纤溶酶注射液对糖尿病肾病大鼠的治疗作用及机制研究

孟凡彩　李海静　赵振莹

【摘要】 目的 探讨纤溶酶注射液（FI）对链脲佐菌素（STZ）诱导的大鼠糖尿病肾病（DN）的治疗作用及机制。方法 40只SD大鼠， 随机分成正常对照组（NC组， 10只）和研究组（30只）。研究组采用STZ注射诱导大鼠模型成功20只， 随机分为DN组和DN+FI组， 各10只。DN+FI组大鼠用FI每日尾静脉注射， 对DN组大鼠进行连续8周治疗。每日观察各组大鼠的一般状况， 计算肾脏脏器系数， 光镜检查肾组织形态改变， 生化法检测尿蛋白（UP）量、血清超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性， 蛋白质印迹法检测肾皮质组织中纤溶酶原活化抑制因子-1 （PAI-1）蛋白的表达量。结果 经FI治疗后， DN组大鼠的一般状况逐渐接近正常， 肾脏脏器系数降低， UP量减少， 肾组织病理变化明显改善， 与NC组比较， DN组大鼠血清的SOD、CAT活性明显降低， UP含量明显增加， 差异具有统计学意义（P<0.05）。而与DN组大鼠比较， DN+FI组大鼠的SOD、CAT活性显著提高， UP含量明显降低， 差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 FI对STZ诱导的DN大鼠肾脏具有明显的保护作用， 其机制可能与其提高机体抗氧化能力、降低肾组织PAI-1蛋白表达有关。

【关键词】 纤溶酶注射液；糖尿病肾病；大鼠；超氧化物歧化酶；过氧化氢酶；纤溶酶原活化抑制因子-1

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.20.107

糖尿病肾病（diabetic nephropathy， DN）是糖尿病（diabe?tesmellitus， DM）最主要的微血管并发症， 也是导致慢性肾衰竭的主要原因之一。DM病程10年以上者約50%并发DN。每年新增终末肾病中， DN所占比例逐年升高[1]。DN早期的主要病理特征是肾小球肥大， 肾小球和肾小管基底膜增厚、系膜区细胞外基质的进行性积聚以及微血栓的形成。后期为肾小球、肾小管间质的纤维化， 最终导致蛋白尿和肾功能衰竭。氧化应激是导致DM慢性并发症的最根本原因之一[2]。由于DN患者体内糖代谢紊乱， 持续清除活性氧簇（reactive oxygen species， ROS）的抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxide dismutas， SOD）、过氧化氢酶（catalase， CAT）等含量明显降低， 导致氧化应激水平增高， 最终损伤肾组织[3]。凝血和纤溶系统的紊乱也是DN发生的一种重要机制。DN患者体内血液普遍存在的高凝状态和血管病变与纤溶酶原活化抑制因子-1 （plasminogen activator inhibitor-1， PAI-1）的高表达高度相关[4]， 这提示PAI-1的表达增多在DN发生中发挥重要作用。对DN患者进行早期干预治疗具有重要的临床意义。改善肾微循环是对DN患者早期干预治疗的一个重要方面[5]。纤溶酶注射液（fibrinogenase injection， FI）内含纤维蛋白溶解酶， 能够降低血小板聚集及血液粘度， 改善微循环。纤溶酶注射液常用于治疗心血管疾病如动脉硬化性脑病、脑梗死、下肢深静脉血栓等具有较好的疗效[6]。然而， FI用于早期干预治疗DN还未有报导。鉴于此， 本文诱导了DN大鼠来研究FI对DN大鼠的治疗效果， 并探讨可能的机制。

1 材料与方法

1. 1 实验动物 选取清洁级雄性SD大鼠40只， 8周龄， 体重180～220 g， 购自临沂市实验动物中心。动物单笼饲养， 自由摄食、饮水， 饲养室温度保持在（22±2）℃， 自然光照， 适应3 d后用于实验。随机分成正常对照组（NC组， 10只）和研究组（30只）。

1. 2 试剂 链脲佐菌素（streptozotocin， STZ）、SOD、CAT检测试剂盒均购自Sigma 公司（St. Louis， MO， USA）；尿蛋白（urine protein， UP）考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购自上海索莱宝生物科技有限公司；FI购自北京赛升药业股份有限公司；PAI-1小鼠单克隆抗体（C-9）、兔抗鼠IgG-HRP单克隆抗体均购自Santa Cruz 公司（Santa Cruz， CA， USA）。

1. 3 试验方法 研究组大鼠禁食12 h后一次性腹腔注射STZ 50 mg/kg（溶于0.1 mol/L， pH=4.2的无菌枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液中， 终浓度为1%， 现配现用）， 注射72 h后连续3 d大鼠尾静脉采血检测血糖。以连续3次血糖浓度>16.7 mmol/L， 尿量>原尿量150%， UP排泄>30 mg/24 h尿者为成模标准。最终， 建模成功的大鼠20只， 成功率67%。NC组大鼠给予等量缓冲液注射。研究组大鼠随机分为DN组和DN+FI组， 各10只。

1. 4 动物给药及样品收集 DN+FI组大鼠采用尾静脉注射2 U/kg的FI（溶于生理盐水， 1 U/ml）， 连续给药8周， NC组和DN组给予等量的生理盐水。各组实验大鼠于8周后处死， 处死前1 d代谢笼收集24 h尿液， 记录尿量， 麻醉后， 称重、颈动脉取血， 分离血清。尿液、血清置于﹣80℃冰箱保存， 用于检测生化指标。同时分离肾脏， 用滤纸吸干后称重， 一侧肾脏置﹣80℃冰箱保存供Western blotting检测用， 部分肾脏以10%中性甲醛固定， 用于组织病理学检查。

1. 5 组织病理学检查 经甲醛溶液固定的肾脏组织， 常规酒精脱水、透明、石蜡包埋后， 连续4 μm 切片， 苏木素伊红染色（HE）后， 在光镜下观察肾脏的组织形态学变化。

1. 6 生化指标测定 检测UP、血清SOD、CAT的含量， 均按试剂盒的说明书操作。血糖浓度用强生血糖仪测定。

1. 7 蛋白质印迹法 肾皮质组织经充分匀浆， 离心后取上清作为蛋白提取物。等量的蛋白 （50 μg） 在加入上样缓冲液充分混匀后， 沸水浴煮5 min， 瞬时离心后进行 SDS-PAGE。电泳后的蛋白用恒流湿法转移到硝酸纤维素膜上。蛋白膜经封阻、洗涤后与PAI-1一抗在4℃孵育杂交过夜。洗膜后加入IgG-HRP二抗， 在室温下孵育杂交2 h。蛋白膜洗涤后， 在膜的蛋白面滴加等比例混合 ECL 检测液 A 和 B， 用 Bio-Rad ChemiDocXRS （Hercules， CA， USA） 曝光， 截获图像。endprint

1. 8 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 一般状况 DN组注射STZ诱导DM后， 进食量在病变初期增加， 病变后期食量减少、尿频且量多、体重减轻、生长缓慢、毛发枯槁发黄等状况。而NC组大鼠食量、饮水、尿量及精神状态基本正常。经FI治疗后， DN+FI组大鼠的饮水、食量、尿量、体重、毛发均逐渐接近正常。

2. 2 脏器系数 与NC组大鼠比较， DN组大鼠其脏器系数显著增加， 经DN+FI组大鼠脏器系数明显降低。

2. 3 肾组织病理变化 病理组织学检查显示， DN组大鼠肾小球充血水肿明显， 体积增大， 肾小管上皮细胞变性坏死脱落， 基底膜破坏， 部分结构不清。DN+FI组大鼠肾组织结构明显改善， 只表现为轻微的充血， 管腔分开， 基底膜完整， 结构清晰， 肾小球和肾小管结构接近正常。见图1。

2. 4 血清中SOD、CAT、UP情况 与NC组比较， DN组大鼠血清的SOD、CAT活性明显降低， UP含量明显增加， 差异具有统计学意义（P<0.05）。而与DN组大鼠比较， DN+FI组大鼠的SOD、CAT活性显著提高， UP含量明显降低， 差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2. 5 肾皮质组织中PAI-1蛋白表达 各实验组大鼠肾皮质组织中均可检测到PAI-1蛋白的表达。DN组大鼠肾皮质组织中PAI-1的表达量明显高于NC组大鼠。相对于DN组大鼠， DN+FI组其肾皮质组织中PAI-1的表达量显著降低。见图2。

3 讨论

DN是DM常见而严重的微血管并发症， 与血栓形成密切相关， 改善微循环是治疗DN的一个重要方面。临床上已经证实FI可以改善纤溶系统的功能， 在治疗动脉硬化性脑病、脑梗死、下肢深静脉血栓等疾病时获得了较好的效果。然而， FI用于早期干预治疗DN却未见报导。在本研究中， 通过建立DN大鼠模型来初步探讨FI对DN的治疗作用及其可能的机制。

采用FI对DN大鼠模型进行8周的治疗后发现， DN大鼠的主要症状和肾脏病理改变均得到很大的改善。经过治疗后， DN大鼠的饮水、食量、尿量、体重、毛发均逐渐接近正常， 脏器系数明显降低。病理组织学检查显示， 治疗后DN大鼠肾组织结构明显改善， 只表现为轻微的充血， 管腔分开， 基底膜完整， 结构清晰， 肾小球和肾小管结构接近正常。这说明FI对DN大鼠的干预治疗是有效的。以往的临床实验已经证实， FI治疗血栓行心血管疾病效果明显， 且不降解凝血因子、补体、血浆蛋白等， 出血并发症少， 是直接作用于血栓病灶的溶栓药物， 安全性高[7]。但FI是否真正能够应用于临床上治疗DN还需要严格的临床实验来证实。

近年来越来越多的证据表明氧化应激是各种途径导致DN病变的共同机制。在本研究中， 用FI对DN大鼠模型进行治疗后， 其血清中抗氧化酶SOD、CAT活性显著提高。这提示DN大鼠体内的氧化应激状态得到明显的改善， FI可能通过提高DN大鼠体内的抗氧化能力的机制来保护肾脏。PAI-1主要由血管内皮细胞合成， 可抑制纤溶酶原的活化， 降低肾小球和肾小管间质细胞外基质的降解， 促进组织细胞外基质的积聚， 加速DN的发生[8-10]。本研究结果显示， DN大鼠在经FI治疗后， 其肾皮质组织中PAI-1的表达量显著降低。这提示FI对DN大鼠的治疗作用可能是通过抑制PAI-1的表达， 促进纤溶酶原的活化， 从而加快肾小球和肾小管间质细胞外基质的降解的机制来实现。

参考文献

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[收稿日期：2017-04-28]endprint