不同蜜炙方法对红芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素含量的影响

牛江涛 曹瑞 司昕蕾 边甜甜 李越峰

摘要：目的 比較不同蜜炙方法对红芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素含量的影响，为其蜜炙最佳工艺的建立提供依据。方法 采用传统炒制、烘制、微波制的方法蜜炙红芪；采用Agilent HC-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流动相为乙腈-0.01%磷酸水溶液，梯度洗脱（0～12 min，30%～33%乙腈；12～13 min，31%～40%乙腈，13～25 min，40%乙腈），流速1.0 mL/min，检测波长248 nm，柱温30 ℃，进样量10 ?L。结果 红芪不同蜜炙品中毛蕊异黄酮和芒柄花素含量存在差异。红芪烘制炙品中毛蕊异黄酮和芒柄花素含量最高，分别为7.911 6、49.699 6 ?g/g；红芪传统炙品中二者含量最低，分别为4.776 7、37.291 0 ?g/g；红芪生品和红芪微波炙品中二者含量相当，分别为5.080 2、42.798 9 ?g/g和3.983 9、42.314 5 ?g/g。结论 不同蜜炙方法对红芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素含量有一定影响，烘制炙法是红芪蜜炙的最优方法。

关键词：红芪；蜜炙；毛蕊异黄酮；芒柄花素

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.

中图分类号：R283.3 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）09-

Effects of Different Honey Sunburn Methods on Calycosin and Formononetin in Hedysari Radix NIU Jiang-tao， CAO Rui， SI Xin-lei， BIAN Tian-tian， LI Yue-feng （1. Gansu University of Chinese Medicine， Key Laboratory of Standard and Quality of Chinese Medicine Research of Gansu Province， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To compare the effects of different methods of honey sunburn on the contents of calycosin and formononetin in Hedysari Radix； To provide the basis for the establishment of the optimum processing technology. Methods By frying （traditional method）， baking， and microwave methods put Hedysari Radix under honey sunburn. Agilent HC-C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m） was used； the mobile phase was acetonitrile-0.01% phosphoric acid solution， gradient elution （0–12 min， 30%–33% acetonitrile； 12–13 min， 31%–40% acetonitrile； 13–25 min， 40% acetonitrile） with velocity of 1.0 mL/min； detection wavelength was 248 nm； the column temperature was 30 ℃； sample volume was 10 ?L. Results There was statistical significance in the contents of calycosin and formononetin of different methods of honey sunburn for Hedysari Radix. Among them， the contents of calycosin and formononetin in Hedysari Radix processed by honey roast were the highest， 7.911 6 and 49.699 6 ?g/g， respectively； the contents of calycosin and formononetin in Hedysari Radix processed by traditional method were the lowest， 4.776 7 and 37.291 0 ?g/g， respectively； the contents of calycosin and formononetin in raw Hedysari Radix and Hedysari Radix by honey microwave method were the same， 5.080 2， 42.798 9 ?g/g， and 3.983 9， 42.314 5 ?g/g， respectively. Conclusion Different honey sunburn methods for the contents of calycosin and formononetin in Hedysari Radix have certain effects， and honey roast method is the optimum method.

Key words： Hedysari Radix； honey sunburn； calycosin； formononetin

基金项目：国家自然科学基金（81460611）；教育部科學技术研究重点项目（212186）；甘肃省自然科学研究基金计划（1010RJZA212、145RJZA076）；甘肃省高等学校基本科研业务费专项资金（2013-2）；甘肃省中医药管理局科研立项项目（GZK-2015-57）；兰州市科技计划项目（2014-1-188）

通讯作者：李越峰，E-mail：lyfyxk@126.com

红芪为豆科植物多序岩黄芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.的干燥根，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、托毒排脓、敛疮生肌功效。炙红芪为红芪的蜜炙炮制加工品，具有补中益气功效，用于气虚乏力、食少便溏[1]。毛蕊异黄酮和芒柄花素具有抗氧化、抗病毒、抗缺血、抗菌、降血脂和改善血象等作用[2-4]，是红芪的主要活性成分。传统炙红芪炮制时火候不易控制，且翻炒不及时或不均匀都会导致受热不均匀，容易炒焦或炒炙不够，造成蜜炙红芪品相不好，某些成分因温度过高而分解，不利于蜜炙红芪的质量控制和标准化生产。而采用烘制和微波蜜炙红芪，具有控温容易、受热均匀、操作简便等优点，有利于提高炙红芪质量，促进其标准化生产。本研究比较不同蜜炙工艺对红芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素2种异黄酮类含量的影响，为建立最优蜜炙炮制工艺提供依据。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司），美的MM721AC8-PW微波炉（佛山市顺德区美的微波炉电器制造有限公司），101-2A型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司），AL104万分之一分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司），SB-5200 DTD超声清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），BT125D十万分之一分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司），2N-04A粉碎机（北京兴时利和科技发展有限公司），HHS11S电热恒温水浴锅（余姚市上通温控仪器厂）。

试验所用红芪药材样品采自甘肃省陇南市武都区米仓山，经甘肃中医药大学药学院中药鉴定教研室王明伟副教授鉴定为豆科植物多序岩黄芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz.的干燥根。毛蕊异黄酮对照品（批号150629，HPLC≥98%）、芒柄花素对照品（批号150419，HPLC≥98%），北京北纳创联生物技术研究院；甲醇（色谱纯，批号20160305）、乙腈（色谱纯，批号20151201），天津市大茂化学试剂厂；无水乙醇（分析纯，批号20151202），天津市富宇精细化工有限公司；磷酸（色谱纯，批号20150707），天津市科密欧化学试剂有限公司；水为娃哈哈纯净水，蜂蜜为槐花蜜（桂林周氏顺发食品有限责任公司）。

2 方法与结果

2.1 炙红芪的制备

2.1.1 传统炙品 根据2015年版《中华人民共和国药典》，将红芪药材按要求切制为0.2～0.4 cm的厚片，取一定量红芪饮片，加炼蜜闷润1 h，用文火炒至不粘手、表面红棕色、略有光泽、具蜜香气，铲出放凉即可。每100 g红芪用炼蜜25 g。

2.1.2 烘制炙品 取一定量红芪饮片，加炼蜜闷润1 h，每100 g红芪加炼蜜25 g。将闷润好的红芪饮片置于磁碟中，厚度为3 cm，放入烘箱。烘制温度为70 ℃，时间2.5 h，烘制完成后，取出放凉即可[5]。

2.1.3 微波炙品 取一定量红芪饮片，加炼蜜，闷润1 h，每100 g红芪加炼蜜25 g。将闷润好的红芪饮片置于磁碟中，厚度2 cm，放入微波炉中。微波火力为低火（350 W，输出功率50%），时间5 min，微波制完成后，取出放凉即可[6]。

2.2 供试品溶液制备

分别精确称取已过20目筛的红芪不同炙品粉末各2.0 g，置150 mL锥形瓶中，精密加入甲醇30 mL，75 ℃水浴回流提取1 h，冰箱4 ℃放置冷却，用定性滤纸过滤于100 mL蒸发皿中，45 ℃水浴浓缩，精密移至10 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度线，摇匀，再过0.45 ?m滤膜，摇匀，作为供试品溶液，备用[7]。

2.3 混合对照品溶液制备

分别精密称取毛蕊异黄酮和芒柄花素对照品0.97、3.99 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解，定容于10 mL容量瓶中，作为贮备液A、B。分别精密吸取2种对照品贮备液2 mL，用甲醇定容至10 mL，制成混合对照品溶液。

2.4 色谱条件

采用Agilent HC-C18（2）柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流动相为乙腈-0.01%磷酸水溶液，梯度洗脱（0～12 min，30%～33%乙腈；12～13 min，31%～40%乙腈；13～25 min，40%乙腈）；流速1.0 mL/min；检测波长248 nm；柱温30 ℃；进样量10 ?L。在此色谱条件下，色谱图分离度良好（见图1）。

2.5 标准曲线绘制

分别精密吸取一定量“2.3”项下贮备液A、B，制成系列浓度的混合对照品溶液（其中毛蕊异黄酮浓度为0.242 5、0.485 0、0.727 5、0.970 0、1.455 0、1.940 0 ?g/mL，芒柄花素浓度为3.990、5.985、7.980、9.975、11.970、13.965 ?g/mL），进样10 ?L，测定峰面积。以浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程及其线性范围，见表1。

2.6 精密度试验

精密吸取“2.3”项下毛蕊异黄酮和芒柄花素对照品贮备液，连续进样6次，按“2.4”项下色谱条件测定并计算。结果毛蕊异黄酮、芒柄花素峰面积RSD分别为0.16%、0.77%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取同一红芪供试品溶液，于4 ℃放置保存，分别于0、4、8、12、20、24 h进样检测，测定峰面积积分值并分别计算其RSD。结果毛蕊异黄酮、芒柄花素峰面积RSD分别为1.56%、0.55%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 重复性试验

精密称取同一份红芪样品（烘制，90 ℃，烘制2 h，厚度1 cm）粉末6份，按“2.2”项下方法制成6份供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件测定，分别计算各成分含量的RSD。结果毛蕊异黄酮的平均含量为4.44 ?g/g，RSD=2.80%；芒柄花素的平均含量为39.91 ?g/g，RSD=0.40%。

2.9 加样回收率试验

精密稱取已知毛蕊异黄酮和芒柄花素含量的同一红芪样品（红芪生品）6份，每份约1.0 g，精密加入等量的毛蕊异黄酮和芒柄花素对照品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件测定。结果毛蕊异黄酮和芒柄花素平均回收率分别为96.31%和96.29%，RSD分别为0.89%和1.13%。

2.10 样品含量测定

精密称取红芪生品及不同蜜炙品，制备供试品溶液，测定毛蕊异黄酮和芒柄花素含量，结果见表2。

3 讨论

在供试品溶液的制备过程中，参照文献[7-8]中的提取方法，对提取溶剂的选择、料液比、提取方法、提取温度、提取次数等做了比较和考察，最终优选出供试品溶液的制备方法：甲醇为提取溶剂，料液比为1∶15（红芪样品粉末2.0 g，甲醇30 mL），回流提取，提取1次，提取温度为80 ℃，提取时间为1 h。

色谱条件的选择，考察了流动相的种类、比例及检测波长。以甲醇-水为流动相洗脱时，色谱背景吸收较强，基线漂移较重，色谱峰数目较少，峰形不好。采用乙腈-水为流动相洗脱时，背景吸收较弱，基线较好，色谱峰数目较多，但仍有部分峰没有完全分离，峰形不好，存在拖尾现象。采用乙腈-0.01%磷酸水为流动相洗脱时，色谱峰数目较多，峰形较好，能除去拖尾现象，达到极限分离的目的。故选用乙腈-0.01%磷酸水为流动相。通过190～400 nm全波段扫描发现，在248 nm处有最大吸收且基线稳定，毛蕊异黄酮和芒柄花素峰形最好，峰面积最大，因此确定248 nm为检测波长。

样品含量测定结果表明，红芪传统炙品中毛蕊异黄酮和芒柄花素含量最低，这可能由于炒制过程中受热不均匀，局部温度过高，而使毛蕊异黄酮和芒柄花素部分分解。与红芪生品相比，红芪微波炙品中2种成分含量也有所降低，可能由于这2种异黄酮类成分在微波辐射下部分分解。红芪烘制炙品中毛蕊异黄酮和芒柄花素含量最高，可能由于烘制过程中红芪饮片受热均匀且温度较低（70 ℃），防止了毛蕊异黄酮和芒柄花素分解，且烘制过程使红芪饮片变得酥脆，有利于有效成分的溶出。可见，不同的蜜炙工艺对红芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素含量有一定的影响。本研究表明，烘制法蜜炙红芪控温容易、受热均匀、操作简便，是红芪蜜炙的最优方法。

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：152-153.

[2] 张鑫，杨英杰，吕庆章.黄芪异黄酮类化合物抗氧化活性的密度泛函理论研究[J].化学研究与应用，2012，24（11）：1662-1669.

[3] 张蔷，高文远，满淑丽.黄芪中有效成分药理活性的研究进展[J].中国中药杂志，2012，37（21）：3203-3207.

[4] 李成义，王燕，强正泽，等.红芪与黄芪中两个异黄酮类成分含量的比较研究[J].中国现代中药，2014，16（7）：534-537.

[5] 朱卫星，李爱光，陈方，等.正交实验优选恒温干燥法蜜炙甘草的工艺研究[J].时珍国医国药，2006，17（8）：1407-1408.

[6] 李越峰，严兴科.正交试验法优选甘草最佳微波炮制工艺[J].中药材， 2012，35（2）：202-203.

[7] 王燕.甘肃地产药材红芪的质量评价研究[D].兰州：甘肃中医药大学， 2015.

[8] 封士兰，胡芳弟，赵健雄，等.高效液相色谱法研究红芪指纹图谱[J].分析化学，2004，32（6）：710-714.

（收稿日期：2017-01-14）

（修回日期：2017-02-21；编辑：陈静）