土鳖虫不同酶解提取物的体外抑菌活性研究

赵红玲，邓淑华，郝 婷，尹毛毛，尹志峰，王良友

(承德医学院 中药研究所 河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000)

土鳖虫不同酶解提取物的体外抑菌活性研究

赵红玲，邓淑华，郝 婷，尹毛毛，尹志峰，王良友*

(承德医学院 中药研究所 河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000)

采用不同酶酶解土鳖虫粉，用 Folin酚比色法测定不同酶解提取物的质量得率和肽含量；然后以金黄色葡萄球菌、白葡萄球菌和大肠埃希氏杆菌为受试菌株，通过体外抑菌实验测定酶解提取物的抑菌活性。结果表明，土鳖虫胃蛋白酶酶解提取物的肽含量最高，达到36.5%；胃蛋白酶酶解提取物对3种受试菌株均有不同程度的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)分别为12.5 mg·mL-1和25.0 mg·mL-1。

土鳖虫；酶解；体外抑菌活性；抗菌肽

土鳖虫为鳖蠊科Eupolyphaga sinesisWallker的雌虫干燥体，是一种珍贵的虫药资源，含有较多活性成分：蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、微量元素、生物碱和脂溶性维生素等[1-2]，在增强机体免疫力、抗炎、抗凝血、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、预防心血管疾病等方面具有较好的作用[3-7]，有较高的营养和药用价值，已被开发成食物原料，如营养价值较高的蛋白质补充剂：中华地鳖酒、中华地鳖胶囊、地鳖虫氨基酸口服液等。

昆虫提取物具有抗生素活性，是潜在的天然抗生素，具有一定的开发前景。目前，国内外对昆虫体内抗菌物质的研究主要集中在凝集素、溶菌酶及抗菌肽[8-10]等。其中，虫类抗菌肽已成为国内外的研究热点之一，如从蚂蚁、蜘蛛等毒素中提取抗菌蛋白，从丝光绿蝇、美洲大蠊等中分离抗菌肽物质[11-14]，从金边地鳖[15]、中华真地鳖[16]中采用乙酸乙酯等方法提取抑菌活性物质，但关于土鳖虫抗菌肽的研究尚未见报道，有效抑菌活性成分及作用机制也尚未明确。因此，作者采用不同蛋白酶酶解土鳖虫粉得到富含肽类的提取物，以金黄色葡萄球菌、白葡萄球菌和大肠埃希氏杆菌为受试菌株进行体外抑菌实验，测定最低抑菌浓度 (MIC)和最低杀菌浓度(MBC)，评价土鳖虫酶解提取物的体外抑菌活性，为进一步研究土鳖虫活性成分及应用开发提供科学依据。

1 实验

1.1 药材与受试菌株

土鳖虫药材购自同仁堂大药房，经承德医学院中药研究所赵春颖教授鉴定，符合2010版药典规定。土鳖虫干燥体粉碎，过80目筛，备用。

金黄色葡萄球菌标准株(26001-26)、白葡萄球菌标准株(26069-5)、大肠埃希氏杆菌标准株(44113-10)均购自中国食品药品检定研究院。

1.2 试剂与仪器

营养肉汤(批号20150701)、营养琼脂(批号20150508)，北京奥博星生物技术有限责任公司；牛血清白蛋白、胃蛋白酶(EC.3.4.23.1)、胰蛋白酶(EC.3.4.21.4)、糜蛋白酶(EC.3.4.21.1)，Sigma公司； Folin酚检测试剂盒(编号C505031)，Sangon Biotech公司；阳性对照药氨苄西林胶囊(批号 19855)，香港联邦制药厂有限公司。

HH-400型电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；JA2003型电子天平，上海天平仪器厂；KQ-500B型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；SHINVA型手提式压力蒸汽灭菌器，山东新华医疗器械股份有限公司；一次性培养板，浙江拱东医疗科技有限公司；倒置显微镜，重庆光学仪器厂；Spectrum-752型紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；无菌平皿。

1.3 方法

1.3.1 土鳖虫酶解提取物的制备[17]

称取10 g土鳖虫粉4份，分别置于500 mL圆底烧瓶中。一份加入200 mL人工胃液、0.6 g胃蛋白酶，于37 ℃水浴恒温振荡器中酶解3 h；一份加入200 mL人工结肠液、0.6 g胰蛋白酶，于37 ℃水浴恒温振荡器中酶解3 h；一份加入200 mL人工结肠液、0.6 g糜蛋白酶，于37 ℃水浴恒温振荡器中酶解3 h；一份加入200 mL人工胃液、0.6 g胃蛋白酶，于37 ℃ 水浴恒温振荡器中酶解3 h后，用1 mol·L-1NaOH溶液调节酶解液pH值至7.5，再加入0.6 g胰蛋白酶，于37 ℃酶解3 h。反应结束后均于100 ℃水浴灭活15 min，4 000 r·min-1离心15 min，取上清液，冷冻，干燥，称重，计算质量得率。

分别称取上述 4种土鳖虫酶解提取物干粉1.000 g，每份加灭菌蒸馏水5 mL溶解，配制成0.200 g·mL-1的酶解提取物溶液，备用。

1.3.2 土鳖虫酶解提取物肽含量的测定(Folin酚比色法)[18]

肽含量测定标准曲线的绘制：在分析天平上精确称取0.010 g结晶牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，配制成0.100 mg·mL-1的蛋白标准溶液；根据试剂盒说明配制工作液，充分混匀。分别精密量取0 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL、50 μL、60 μL、70 μL、80 μL、90 μL、100 μL蛋白标准溶液置于离心管中，加水至200 μL；加入1 mL工作液，混匀，室温静置10 min；加入100 μL Folin酚试剂，迅速混匀，室温静置30 min；用分光光度计测定750 nm处吸光度。以吸光度(A750)为纵坐标、蛋白标准溶液浓度(c)为横坐标绘制标准曲线。

肽含量的测定：分别精密量取4种土鳖虫酶解提取物溶液，置于100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为供试品溶液，按上法测定吸光度，根据回归方程计算肽含量。

1.3.3 土鳖虫酶解提取物体外抑菌实验

水利工程施工建设要尽量避免在冬季或温度较低的深秋环境下进行，根本原因在于，气候条件恶劣会影响软土地基施工环节的深层搅拌桩处理。由此可见，水利施工技术人员要在处理深层搅拌桩前，密切关注施工区域的天气变化情况，综合考量环境因素。

菌液的配制：分别将金黄色葡萄球菌标准株、白葡萄球菌标准株和大肠埃希氏杆菌标准株在营养肉汤培养基中37 ℃增菌培养18 h，备用。

体外抑菌实验(打孔法)[19]：按比浊法将菌液用培养基稀释至细菌浓度为10-7个·mL-1的菌悬液，用无菌吸管吸取菌悬液100 μL到琼脂平板上，以无菌载玻片将菌悬液涂布均匀，再用直径为6 mm的无菌打孔器打孔，每皿打4孔，其中2孔加入0.200 g·mL-1酶解提取物溶液100 μL，1孔为空白对照，1孔为阳性对照氨苄西林(0.002 g·mL-1)，于37 ℃生化培养箱中培养18 h，以有无抑菌圈初步判断有无抑菌活性。每种酶解提取物均进行3次重复实验。

MIC的测定[20]：将有抑菌圈的酶解提取物溶液，采用倍比稀释法分别用营养肉汤培养基进行8个浓度的倍比稀释。取预处理过的无菌24孔细胞培养板，每个稀释度对应设置2个复孔，每孔加入1 mL稀释酶解提取物溶液。将菌液用培养基稀释1 000倍，每孔加入50 μL稀释菌液，其中2孔只加培养液和50 μL稀释菌液作为空白对照，置于37 ℃恒温培养箱中恒温培养18 h，取出，用倒置显微镜观察细菌生长状况，以无细菌生长的最低浓度为MIC。

MBC的测定：平板高温灭菌20 min，将已冷却至50～60 ℃的普通琼脂培养基倒入无菌平板上(培养基厚度4～8 mm)，凝固后备用。选择在24孔细胞培养板上无细菌生长的培养物100 μL接种于普通琼脂平板培养基。以无菌载玻片均匀涂布，标记平板，倒置。于37 ℃恒温培养箱中恒温培养18 h，取出，计数菌落，以菌落数少于5个(2个复孔的平均值)的最低浓度为MBC。

1.4 统计学分析

应用软件SPSS20.0对结果进行分析，两组间均数比较采用t检验。

2 结果与讨论

2.1 肽含量测定标准曲线(图1)

图1 肽含量测定标准曲线

从图1可以看出，蛋白标准溶液在0～0.100 mg·mL-1范围内与A750线性关系良好，线性回归方程为：A750=4.4464c+0.0618，R=0.9994。

图2 酶解提取物的质量得率及肽含量

从图2可以看出，仿生酶酶解提取物的质量得率最高，达到68.7%；胃蛋白酶酶解提取物的肽含量最高，达到36.5%；不同酶酶解提取物的肽含量高低依次为胃蛋白酶>仿生酶>糜蛋白酶>胰蛋白酶。

2.3 酶解提取物的体外抑菌活性评价

4种酶解提取物的抑菌效果如表1所示。

表1 4种酶解提取物的抑菌效果

Tab.1 Antibacterial efficiency of four enzymolysis extracts

酶解提取物浓度g·mL-1金黄色葡萄球菌白葡萄球菌大肠埃希氏杆菌胃蛋白酶0．200+++胰蛋白酶0．200---糜蛋白酶0．200---仿生酶0．200---氨苄西林0．002+++

注：“+”表示有抑菌圈，抑菌活性呈阳性；“-”表示无抑菌圈，抑菌活性呈阴性。

从表1可以看出，0.200 g·mL-1的胰蛋白酶酶解提取物、糜蛋白酶酶解提取物、仿生酶酶解提取物对金黄色葡萄球菌、白葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌没有抑菌活性，而胃蛋白酶酶解提取物(0.200 g·mL-1)和阳性对照氨苄西林(0.002 g·mL-1)对3种受试菌株均显示出不同程度的抑菌活性。

将产生抑菌圈的胃蛋白酶酶解提取物进一步倍比稀释，进行体外抑菌实验，测定抑菌参数MIC和MBC，结果见表2。

表2 胃蛋白酶酶解提取物对3种受试菌株的MIC和MBC

从表2可知，土鳖虫胃蛋白酶酶解提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，MIC和MBC分别为12.5 mg·mL-1和25.0 mg·mL-1；对白葡萄球菌和大肠埃希氏杆菌的抑制作用相似，MIC和MBC分别为25.0 mg·mL-1和50.0 mg·mL-1。

3 结论

对土鳖虫酶解提取物的肽含量和体外抑菌活性进行了测定和评价。结果显示，不同酶酶解提取物肽含量的高低依次为：胃蛋白酶>仿生酶>糜蛋白酶>胰蛋白酶，胃蛋白酶酶解提取物的肽含量高达36.5%。体外抑菌实验结果显示仅有胃蛋白酶酶解提取物对革兰氏阴性菌(大肠埃希氏杆菌)及阳性菌(金黄色葡萄球菌及白葡萄球菌)的抑制作用均呈阳性，且具有一定的量效关系，其中对金黄色葡萄球菌最为敏感，MIC和MBC分别为12.5 mg·mL-1和25.0 mg·mL-1。

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InVitroAntibacterial Activity of Different Enzymolysis ExtractsfromEupolyphagasinesisWallker

ZHAO Hong-ling,DENG Shu-hua,HAO Ting,YIN Mao-mao,YIN Zhi-feng,WANG Liang-you*

(KeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineResearchandDevelopmentofHebeiProvince,InstituteofTraditionalChineseMedicine,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China)

WeenzymolyzedEupolyphaga sinesisWallkerpowderbyusingdifferentenzymes,anddeterminedthequalityyieldandpeptidecontentindifferentenzymolysisextractsbyFolinphenolcolorimetry.Then,usingStaphylococcus aureus,Staphylococcus albus,andEscherichia coliastestingstrains,wedeterminedtheantibacterialactivityofenzymolysisextractbyin vitroantibacterialexperiment.Resultsindicatedthatthepeptidecontentinpepsinenzymolysisextractwasthehighestof36.5%.Pepsinenzymolysisextracthaddifferentdegreesofantibacterialeffectsagainstthreetestingstrains,inwhichtheantibacterialeffectsagainstStaphylococcus aureuswasthebestwithMICof12.5mg·mL-1andMBCof25.0mg·mL-1.

Eupolyphaga sinesisWallker;enzymolysis;in vitroantibacterialactivity;antibacterialpeptide

河北省海外高层次人才“百人计划”项目(E201200002)，河北省中医药管理局中药类科研计划项目(2017189)，承德医学院大学生创新训练计划项目(201616)

2017-04-06

赵红玲(1977-)，女，蒙古族，辽宁镇赉人，助理研究员，研究方向：生物活性多肽药物，E-mail：zhldxy@163.com；通讯作者：王良友，副教授。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.08.012

R284.2

A

1672-5425(2017)08-0059-04

赵红玲，邓淑华，郝婷，等.土鳖虫不同酶解提取物的体外抑菌活性研究[J].化学与生物工程，2017，34(8)：59-62.