慢性心衰患者血清致伤血管内皮细胞及黄芪注射液的干预作用

钟伟+区少兰+韩蕊+刘裔军

【摘要】 目的 探讨慢性心力衰竭（CHF）患者血清致伤血管内皮细胞（VEC）损伤的病理状态及黄芪注射液的保护干预机制。方法 32例CHF患者作为CHF组， 同期在本院体检健康者40例作为正常对照组， 取对数生长期人脐静脉内皮细胞， 培养接种后分为A、B、C、D、E组五组， 继续培养24 h

后A～D组加入含15%CHF患者血清的培养基进行损伤造模， E组加入含15%健康人血清的培养基培养， 分别检测各细胞、因子水平。结果 A～D组经凝胶电泳处理后可得到典型头尾分布彗星图像， 尾长、彗星长、尾距与E组比较， 差异均具有统计学意义 （t=6.650、8.332、15.765， P<0.05） ， 表明DNA有损伤。E组处理后所得到的彗星图像无典型头尾分布特点， 表明DNA无损伤。A～D组光密度（OD）值低于E组， 循环内皮细胞（CEC）、血管内假血友病因子（vWF）及可溶性血栓调节蛋白（sTM）值均高于E组， 差异均具有统计学意义 （t=33.828、8.040、8.978、6.640， P<0.05）。B、C组OD值高于A组， CEC、vWF及sTM值均低于A组， 差异均具有统计学意义 （P<0.05）。结论 CHF患者血清可致伤血管内皮细胞， 造成DNA损伤， 黄芪注射液对致伤血管内皮细胞有保护和改善作用。

【关键词】 慢性心力衰竭；血管内皮细胞；黄芪注射液；DNA损伤

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.24.117

本次研究选取2013年12月～2016年12月在黄埔中医院心血管内科病房住院的32例CHF患者， 利用其血清及血管内皮细胞株建立血管内皮细胞损伤的体外模型， 现将结果报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2013年12月～2016年12月在黄埔中医院心血管内科病房住院的32例CHF患者， 将其归为CHF组， 其中男18例， 女14例， 平均年龄（69.08±3.22）岁， 平均病程（6.23±2.10）个月。选取同期在本院体检健康者40例作为正常对照组。

1. 2 方法

1. 2. 1 实验准备 ①收集两组血清。②配制条件培养基。③制备黄芪注射液。④内皮细胞传代培养。

1. 2. 2 实验操作 取对数生长期人脐静脉内皮细胞， 培养接种后分为A、B、C、D、E组五组， 继续培养24 h后A～D组加入含15%CHF患者血清的培养基进行损伤造模， E组加入含15%健康人血清的培养基培养。以上条件培养基作用24 h后， A～C组分别加入10、20、40 ?g/ml的黄芪注射液， D、E组各自加入等量的DMEM培养基， 培养24 h后进行指标的检测。将条件培养基干预后的A～E组细胞用PBS液洗涤3次， 用培养基制成细胞悬液进行离心处理5 min， 取上清液， 以琼脂糖PBS凝胶固化处理后浸入细胞裂解液， 高pH电泳缓冲液浸泡30 min， <15℃下电泳30 min， 荧光显微镜下观察DNA损伤情况。以上过程需注意动作轻、细以免造成人为细胞DNA损伤， 此外细胞处理及电泳过程需在暗室内进行避免造成实验以外损伤。

1. 3 观察指标 观察各组血管内皮细胞DNA损伤情况（尾长、彗星长、尾距）， 并在黄芪注射液干预前后分别进行以下检测：①MTT法检测细胞活性， 检测结果用OD值表示；②等密度梯度离心法检测CEC数；③lurell火箭电泳法测定血管内vWF浓度；④酶联免疫吸附实验（ELISA） 法测定sTM浓度。

1. 4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 A～D组和E组血管内皮细胞DNA损伤情况 A～D组经凝胶电泳处理后可得到典型头尾分布彗星图像， 尾长、彗星长、尾距与E组比较， 差异均具有统计学意义 （t=6.650、8.332、15.765， P<0.05） ， 表明DNA有损伤。E组处理后所得到的彗星图像无典型头尾分布特点， 表明DNA无损伤。见表1。

2. 2 A～D组和E组在黄芪注射液干预前相关指标检测结果比较 A～D组 OD值低于E組， CEC、vWF及sTM值均高于E组， 差异均具有统计学意义 （t=33.828、8.040、8.978、6.640， P<0.05）。见表2。

2. 3 A～C组在黄芪注射液干预后相关指标检测结果比较 B、C组OD值高于A组， CEC、vWF及sTM值均低于A组， 差异均具有统计学意义 （P<0.05）。见表3。

3 讨论

血管内皮细胞损害以内皮依赖性舒缩反应平衡破坏为主要特征， 机体血流动力学受此影响逐渐恶化[1， 2]， 最近研究公认， 评价血管内皮细胞损伤程度的代表性指标有CEC、vWF和sTM。现有药物在治疗CHF方面均存在较大的局限性， 寻找新的高效药物势在必行， 西药研发周期长毒副作用大， 因此研究者将目光转向中药， 虽然人们已经意识到黄芪的惊人疗效， 但是现有研究多集中在黄芪注射液对分泌功能的影响方面， 有关细胞内部结构变化研究相对较少[3-7]， 因此本次研究通过制作体外血管内皮细胞损伤模型来深入研究黄芪注射液的干预作用。表明CHF患者血清可致伤血管内皮细胞， 造成DNA损伤， 而且黄芪注射液对致伤血管内皮细胞有保护和改善作用， 该项研究必将带来血管内皮细胞药物研制的突破和创新发展。

参考文献

[1] 曹雪梅， 付晓荣， 陈俊芬， 等. 黄芪甲苷对自发性高血压大鼠血管内皮功能的保护作用. 医学临床研究， 2016， 33（6）：1075-1077.

[2] 周春刚， 陆曙， 王书乐， 等. 黄芪与当归不同配比水提液对ANGⅡ诱导大鼠动脉内皮细胞凋亡的实验观察. 中成药， 2013， 35（10）：2253-2256.

[3] 罗映松， 罗庆昌. 慢性心力衰竭患者合并睡眠呼吸紊乱的发生情况及胰岛素、内皮素水平变化. 心血管病防治知识（下半月）， 2013， 5（11）：75-77.

[4] 钟伟， 韩蕊， 区少兰， 等. 慢性心衰患者血管内皮细胞体外损伤模型的研究. 中西医结合心血管病电子杂志， 2014， 2（8）：11.

[5] 彭环庆， 彭志允， 谢维宁， 等. 基于血管内皮细胞损伤模型的丹参酮ⅡA治疗慢性心力衰竭的机制研究. 浙江临床医学， 2015（3）：349-351.

[6] 于亮， 段绍斌， 居来提， 等. 黄芪注射液对两次打击大鼠致多器官功能障碍综合征中心肌和血管内皮细胞损伤的影响. 中国全科医学， 2010， 13（9）：967-970.

[7] 段绍斌， 于亮， 刘郁， 等. 黄芪注射液对多脏器功能障碍综合征模型大鼠血管内皮细胞损伤的影响. 中国现代医学杂志， 2012， 22（1）：5-8.

[收稿日期：2017-04-18]endprint