分娩方式及性别对母乳喂养婴儿肠道菌群的影响

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(1.北京三元食品股份有限公司，北京 100163；2.首都儿科研究所，北京 100020；3.北京市通州区妇幼保健院，北京 101100)

[专题研究]

分娩方式及性别对母乳喂养婴儿肠道菌群的影响

李菊芳1，姜铁民1，贾妮2，侯海鸥3，陈历俊1，戴耀华2

(1.北京三元食品股份有限公司，北京100163；2.首都儿科研究所，北京100020；3.北京市通州区妇幼保健院，北京101100)

目的旨在通过高通量测序技术(Illumina)对母乳喂养婴儿粪便样本的16S rDNA基因进行测序分析，以探索分娩方式和婴儿性别对健康足月婴儿出生后1个月内肠道菌群定植的影响。方法本研究于2015年3至6月在北京市通州区妇幼保健院产科招募刚出生的健康足月新生儿10人。采用Illumina高通量测序技术对纯母乳喂养婴儿的胎粪(1d)，15d和30d的粪便样本中所有微生物的16S rRNA V3+V4进行测序检测。结果胎粪的菌群多样性最高，随着喂养时间的延长，又呈现先降低后升高的趋势；两种分娩方式对肠道菌群定植的影响差异显著：顺产组的肠道菌群多样性均高于剖宫产组；在科水平上拟杆菌科(Bacteroidaceae)在顺产组婴儿肠道菌群中长期存在，且相对丰度较高，而梭菌科(Clostridiaceae)在剖宫产组婴儿肠道中稳定存在；双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)于婴儿出生后15d即开始产生，但顺产组婴儿肠道中此菌群相对丰度远高于剖宫产组(15d和30d时该菌的相对丰度在顺产组和剖宫产组的比例分别为4:1和10:1)；性别对婴儿肠道菌群多样性和丰度无显著影响，但可造成菌群在科水平上菌群构成的差异：到出生后30d时男婴组中丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)相对丰度较高(该菌科相对丰度占总菌科的20%)，女婴组中毛螺菌科(Lachnospiraceae)相对丰度较高(该菌科相对丰度占总菌科的18%)，且这两种菌科在对方组中均为检测到。结论分娩方式对婴儿出生后1月龄内肠道菌群定植规律产生显著影响，而婴儿性别不是肠道菌群定植的关键因素，但在婴儿生长发育过程中会对肠道菌群构成产生一定的影响。

婴儿；分娩方式；性别；肠道菌群

人类体内大约有1014个细菌，超过人类基因数的100倍。最大的微生物群落位于大肠中，它是宿主重要的组成部分，与宿主的健康紧密相连[1-2]。在过去的十几年中，受益于分子生物学技术的发展，人体肠道菌群研究已经取得了巨大的进步，特别是宏基因组理论的提出以及与之相结合的第二代测序技术的逐步普及，为肠道菌群的研究提供了一系列非依赖性培养的微生物研究技术，使得人们对肠道菌群发展变化规律及其影响因素逐步明晰[3-5]。有研究表明肠道菌群在人类的整个生命过程中发挥着重要的作用，例如屏障功能、新陈代谢反应、营养效应以及宿主先天性及适应性免疫反应的成熟[6]。婴儿时期肠道菌群的定植是肠道菌群形成的关键时期，影响未来生长发育和健康状况，与远期肥胖、糖尿病、过敏性疾病等的发生密切相关[7]。

婴儿肠道菌群的结构和组成受多种因素影响，包括来自母体和自身的因素。分娩方式(阴道分娩或剖宫产)已经被证明对早期肠道菌群定植，尤其是双歧杆菌的数量具有非常重要的影响[8-9]。Dominguez-Bello等[10]利用焦磷酸测序的方法分析新生儿胎粪表明，首次肠道微生物菌群的建立与阴道分娩的母亲阴道(乳杆菌，普氏菌或者纤毛菌)或者剖宫产母亲的皮肤(葡萄球菌，棒状杆菌以及丙酸杆菌)有非常强的相关性。同时利用时间温度梯度凝胶电泳(TTGE)和变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析发现，剖宫产婴儿和阴道分娩婴儿出生后3d的粪便样品菌群组成有差异。剖宫产婴儿体内的双歧杆菌数目比阴道分娩婴儿的少，且菌群多样性程度也较低[11]。这些证据表明肠道环境受其首次遇到的皮肤或者阴道带来的微生物菌群的影响。然而，利用免培养方法分析早产儿粪便样品发现分娩方式与各种微生物(包括双歧杆菌)定植水平无关[12]。前人已经对分娩方式造成的婴儿肠道定植差异进行了大量研究，但出生1月龄内不同分娩方式的纯母乳喂养婴儿肠道菌群定植的动态变化情况还需进一步分析。

性别与地域、年龄、饮食结构和健康状况等并列成为成人肠道菌群结构改变的重要影响因素。Bolnick等[13]通过对人类、鱼类和小鼠进行针对性的研究分析，明确了宿主肠道内微生物菌群的组成是取决于宿主的饮食结构与其性别共同作用的，并指出在使用饮食疗法调节肠道微生物菌群失调时，需要根据性别差异来知道不同的治疗方案。Mueller等[14]对来自欧洲4个国家的230个健康成人肠道菌群的多样性分析发现，男性肠道内Bacteroides-Prevotella group的数量显著多于女性。Stanley等[15]的动物实验结果表明不同性别的大鼠尿液代谢物组成有显著差异，且这些差异物为肠道菌群代谢所产生。这说明性别对成人肠道菌群构成产生显著差异，这可能与代谢性疾病的发生有关系。关于婴儿肠道菌群定植时期由性别产生的差异至今鲜见报道。WHO儿童成长测评标准分别针对男童和女童绘制了不同的体重、身长/身高、头围的发育标准曲线(http://www.who.int/en/)，这说明不同性别婴儿的机体代谢及生长发育过程存在差异，那么不同性别婴儿肠道菌群的早期定植及代谢情况是否有差异还需进一步研究。

本研究的目的是采用Illumina高通量测序技术对婴儿出生1个月内肠道菌群的变化规律进行研究，重点考察了分娩方式和婴儿性别对婴儿肠道菌群早期定植的影响。本研究的顺利开展将为今后婴儿肠道微生态的研究提供更科学、更精确的数据支撑，也为开发调节肠道微生态平衡的婴幼儿乳品提供科学依据。

1材料与方法

1.1婴儿粪便样本的采集

1.1.1志愿者招募

本研究于2015年3至6月在北京市通州区妇幼保健院产科招募刚出生的健康足月新生儿10人(其中顺产婴儿5例；剖宫产婴儿5例)，胎龄满37周不满42足周，出生体重为2 500～4 000g，Apgar评分>7分，早开奶，纯母乳喂养；父母无严重的慢性疾病，且在调研期间不会搬迁出调研区。本研究经过首都儿科研究所伦理委员会审批，监护人自愿参加并签署知情同意书。

1.1.2粪便样本采集

采集时间点为：胎粪(1d)、15d和30d。准备取样时给婴儿清洗臀部及肛门，换干净的纸尿裤。取样时，请取样者戴无菌手套，然后用取样勺挖取约5g粪便后放入带有保护液的PSP管中，采集时注意避免粪尿混合。采集好的样品于-80℃冰箱保存。

1.1.3样品编号

粪便样品编号为4位编码，依次表示出生方式、性别、婴儿编号和出生时间，其中第一位字母N或C分别表示顺产和剖宫产，第二位字母B或G分别表示男婴或女婴，第三位数字表示婴儿编号，从0到9，第四位1、2、3分别表示样品采集时间点，即出生1d、15d和30d。

1.2粪便样本基因测序流程

1.2.1 DNA提取

采用粪便基因组提取试剂盒(DP328)(天根生化科技有限公司，中国)提取200mg粪便样本中微生物的总DNA，具体步骤按说明书操作。所提取的DNA于-80℃保存备用。

1.2.2文库构建及测序

取用10ng的DNA模板，对16S rRNA-V3+V4区进行扩增，引物为314F-805R，同时加入特异index序列。文库构建完成后，先使用Qubit 2.0进行定量，稀释扩增产物至1ng/μL，随后对文库的insert size进行检测，符合预期后进行实时荧光定量核酸扩增检测系统(QPCR)，对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。由安诺优达基因科技有限公司采用Miseq进行测序，测序策略为PE250。

1.2.3生物信息学分析

测序后得到的下机数据经过去除低质量碱基、混淆碱基(Ns)、接头污染序列等过程完成数据过滤，得到可信的目标序列(Clean Reads)，用于后续分析。然后将双端测序相应的Read1与Read2利用序列拼接方法PEAR进行拼接[16]。拼接后的序列利用软件QIME 1.8.0版本进行分析[17-19]，包括OTUs的提取、OTUs的交叠分析、聚类分析、Lefse分析、系统发生树的构建、Alpha多样性分析、Beta多样性分析等[20]。

Alpha多样性分析表示样品内的菌群多样性情况，包括菌种的类别丰富度以及菌种数目的均匀度，其描述方式有Chao1、Observed species、shannon和Simpson；Beta多样性分析主要考察样品间的菌群差异情况，其中主坐标分析(PCoA)依赖于Unweighted UniFrac 距离和Weighted UniFrac距离，通过对多维数据降维处理得出数据中最主要的影响因子或元素；聚类分析可用来分析物种结构相似性。

1.3统计学方法

菌群多样性分析数据以平均值±标准差表示，采用IBM SPSS Statistics 22统计软件进行单因素ANOVA分析，显著水平α=0.05。

2结果

2.1分娩方式对母乳喂养婴儿1月龄内肠道菌定植的影响

2.1.1物种丰度及多样性

分类操作单元(OUT)的数量可以代表样品物种的丰度。本研究中将序列相似度大于97%的Tags归为一类OTUs，认为它们具有相同的物种来源。不同分娩方式的纯母乳喂养婴儿在出生后的3个时期肠道微生物的OUT数量和Alpha多样性分析结果见表1。无论何种分娩方式，胎粪中的OUT数量最高，其中顺产组胎粪中OUT数量显著大于其它两个时间点(P<0.05)。随着婴儿的生长OUT数量又呈现逐渐升高的趋势；比较两种分娩方式的结果发现顺产组婴儿在3个不同时间点下OUT数量均高于剖宫产组。

另外，本研究中采用四种不同的Alpha多样性指数表征菌群的丰度和群落的稳定性，结果见表1。Shannon Index是根据样品中的物种种类以及每个物种的比例计算得到的多样性指标，其值越大表示菌群分布越均匀。两组在3个时间点下粪便菌群的分布均匀程度无显著性差异，但顺产组婴儿在各时间点下菌种分布均匀程度均比剖宫产组高；Chao1是一个可以不基于进化树来评价物种丰度的指数，其在低丰度样品特别多的时候更能体现真实的多样性情况，值越大表示样品物种丰度越高，表1显示的结果趋势与OUT数量结果一致：顺产组婴儿粪便菌群丰度高于剖宫产组，胎粪中的菌群丰度最高(P<0.05)；Observed Species是一个对物种丰度进行检测的指数，也即某次实验中观测到的种类数。从表1中可以看出在任意的一次实验中均可得到顺产组的菌群丰度高于剖宫产组，且胎粪的菌群丰度最高这一结果，这也说明本研究结果的可靠性；Simpson是测量一个种群集中程度或优势程度的指数，从表1中可以看出剖宫产组的菌群丰度低于顺产组，但其胎粪菌群集中程度显著高于顺产组(P=0.049)，之后随着年龄的增长，两种分娩方式婴儿粪便的菌群集中程度的差异逐渐减小，但均无显著性差异(均P>0.05)。

表1 顺产组和剖宫产组OUT数量及Alpha多样性

(续表1-1)

时间(d) ObseveredSpecies 顺产剖宫产FP Simpson 顺产剖宫产FP169.92±55.6746.96±39.890.1440.7140.38±0.190.73±0.285.3810.0491522.85±7.3417.89±3.560.0260.8760.45±0.130.59±0.031.5230.2523025.90±8.2120.228±4.540.5880.4650.51±0.140.58±0.132.3070.167F0.9542.5100.1982.176P0.4120.1230.8230.156

2.1.2肠道菌群结构组成差异

图1显示在门水平上出生后不同时间婴儿粪便样品的菌群构成。结果表明胎粪检测到9个主要菌门，但是所有样品中99.13%以上的序列主要由4个菌门组成，分别是放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、后壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)，见图1a；15d时婴儿粪便中共检测到4个菌门，分别是Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria，见图1b；而出生30d时婴儿粪便中共检测到5个菌门，分别是Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria、软壁菌门(Tenericutes)，见图1c。通过丰度计算发现两种分娩方式婴儿在3个时间点下门水平上的优势菌群均为Proteobacteria和Firmicutes。这一结果说明不同分娩方式婴儿在同一时期肠道菌群结构在门水平上差异不显著，但随着出生时间的变化，门水平上菌群构成丰度有一定的差异。

注：图中横坐标表示样品名称，纵坐标表示菌的相对丰度。

图1门水平上不同分娩方式婴儿在出生后不同时间肠道菌群的构成

Fig.1 Intestinal flora composition in infants delivered with different mode at different time after birth at phylum level

对所有样品得到的OTU进行物种注释后，结果显示各样品91%的Tag序列能够注释到“科”的水平，而能够注释到“属”水平的tag仅为4.76%，因此选择“科”作为各个样品的最佳分类水平。图2a表示不同分娩方式婴儿胎粪中肠道菌群构成差异。顺产组中占总菌群60%以上的菌群主要有：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)为22.74%、拟杆菌科(Bacter￣oidaceae)为22.12%和葡萄球菌科(Staphylococcaceae)为16.47%；而在剖宫产组中Enterobacteriaceae为38.84%、梭菌科(Clostridiaceae)为28.89%、Staphylococcaceae为20.72%，三种菌科已占到组菌群含量的88%以上。这表明Enterobacteriaceae和Staphylococcaceae是两种分娩方式婴儿胎粪中的共有菌群，而Bacteroidaceae是顺产组的特异优势菌，Clostridiaceae是剖宫产组的特异优势菌。同时对一些低丰度菌群进行统计分析发现，顺产组中含量约为6.65%的瘤胃菌科(Ruminococcaceae)是剖宫产组中的40倍，而Bacteroi￣daceae和疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)在顺产组和剖宫产组的比例分别为86:1和130:1。尽管这些低丰度菌群含量甚微，但可能其功能及与成年后某些疾病发生的相关性还需进一步研究。

图2b显示不同分娩方式的婴儿在出生后15d婴儿肠道菌群在科水平上的菌群结构。数据结果显示，顺产组在科分类水平上其多样性要高于剖宫产组，其中顺产组中Enterobacteriaceae为40.53%、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)为18.81%、Bacteroidaceae为12.16%，三种菌科占到总菌群的70%以上；在剖宫产组中Enterobacteriaceae为46.61%、Clostridiaceae为37.44%、Erysipelotrichaceae为7.52%，三种菌科已占到总菌群含量的90%以上。从而可知两种分娩方式婴儿的优势菌群均为Enterobacteriaceae，但主要差异菌群为Clostridiaceae，它是剖宫产组的第二菌科，但在顺产组中仅为3.97%，两者相差将近10倍。另外，韦荣球菌科(Veillonellaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)在顺产组和剖宫产组的比例分别为1:4、7:1、4:1，Bacteroidaceae和毛螺菌科(Lachnospiraceae)在顺产组中比例为12.16%和5.96%，在剖宫产组中几乎不存在。

图2c显示不同分娩方式婴儿在出生后30d时肠道菌群在科水平上的菌群构成。统计发现此时顺产组可检测到22个科，而剖宫产组检测到19个科。在顺产组中Enterobacteriaceae为34.05%、Erysipelotrichaceae为18.66%、Bacteroidaceae为12.26%，三种菌科占到总菌群的75%以上；在剖宫产组中Enterobacteriaceae为45.85%、Clostridiaceae为27.79%、Erysipelotrichaceae为11.82%，三种菌科已占到总菌群含量的85%以上。Bacteroidaceae在顺产组为12.26%，而在剖宫产组中几乎不存在，Streptococcaceae、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、孪生菌科(Gemellaceae)在两组中的比例为1:3、100:1、10:1。乳杆菌科(Lactobacillaceae)在两组中无差别，而Bifidobacteriaceae在顺产组占有9.01%，是剖宫产组的10倍。

注：图中横坐标表示样品名称，纵坐标表示菌的相对丰度。

图2科水平上不同分娩方式婴儿在出生后不同时间肠道菌群的构成

Fig.2 Intestinal flora composition in infants delivered with different mode at different time after birth at family level

综合上述结果对婴儿肠道菌群构成变化进行纵向观察发现，Bacteroidaceae在顺产组婴儿肠道菌群中长期存在，且相对丰度较高，而Clostridiaceae在剖宫产组婴儿肠道中稳定存在，这也是两种生产方式婴儿肠道菌群构成的主要差别，见表2。另外，由于顺产婴儿在出生过程中可以与产妇阴道微生物大量接触，而剖宫产婴儿出生时接触到的是经过消毒的母亲皮肤，所以分娩后1d顺产婴儿肠道菌群多样性大于剖宫产者，但这些特异的菌群随着哺乳的开始逐渐消失或者产生新的更多的厌氧菌菌群。同时，本研究结果显示顺产组婴儿肠道中Bifidobacteriaceae于婴儿出生后15d即开始产生，而剖宫产组产生时间较晚，且顺产组婴儿肠道中此菌群相对丰度远高于剖宫产组。

表2 不同分娩方式婴儿肠道相对高丰度菌群比较

2.1.3分娩方式对婴儿肠道菌群构成的聚类分析

为了进一步验证分娩方式对婴儿肠道菌群定植的影响，利用样品间的Weighted UniFrac距离进行PCoA主坐标分析以考察样品间的相似度。图3显示第一和第二主成分，其贡献率分别为30%和13%，此时顺产组分布较疏离，而剖宫产组分布较密集，这可能与顺产组菌群多样性相对较高有关系。总体看顺产组和剖宫产组可以各自聚成一类，这也证明两种分娩方式对肠道菌群构成影响差异性的存在。

图3样品Beta多样性分析

Fig.3 Beta diversity analysis of samples

2.2性别对母乳喂养婴儿1月龄内肠道菌定植的影响

鉴于分娩方式对婴儿肠道菌群的显著影响，在考察性别这一因素时统一选择分娩方式为剖宫产的婴儿，尽量保证其他因素的一致性。

2.2.1物种丰度及多样性

不同性别婴儿粪便样品中OUT数量及Alpha多样性分析结果见表3。经过统计分析发现男婴胎粪中OUT数量略高于女婴，但无显著性差异(P>0.05)。随着两组婴儿的生长，OUT数量均呈现先下降再升高的趋势，但统计分析均无显著性差异，且15d和30d时两组OUT数量相近，这表明性别不会对婴儿肠道菌群多样性产生显著差异。

表3同时展示了Alpha多样性分析的4个指标值。Shannon Index在不同组间和组内不同时间点下均无显著性差异，这说明两组婴儿粪便样本中微生物菌群分布都比较均匀；另外，除了女婴随时间变化Chao1有显著差异(P<0.05)外，各时间点下性别之间表征菌群丰度的Chao1无显著差异；而表征任意一次随机检测菌群丰度的Obsevered Species值在两组之间及不同时间点下均无显著性差异，这表明性别对婴儿肠道菌群的丰度不产生影响；同时两组婴儿在3个时间点下Simpson值均无显著性差异，表明性别对婴儿肠道菌群集中程度无影响。

2.2.2婴儿性别对肠道菌群构成的影响

性别对剖宫产婴儿肠道菌群在科水平上的构成及相对丰度影响见图4。从图中可以看出男婴胎粪中的优势菌群主要为Enterobacteriaceae、Clostridiaceae和Staphylococcaceae，而女婴胎粪中的优势菌群主要为Enterobacteriaceae、Clostridiaceae、Staphylococcaceae和Streptococcaceae，且比较发现男婴组中Enterobacteriaceae和Staphylococcaceae相对丰度高于女婴组，而女婴组中Clostridiaceae的相对丰度高于男婴组。随着婴儿的成长，男婴组中Erysipelotrichaceae的相对丰度显著升高，到30d时约占总菌科的20%，而女婴组中未检测到此菌科。女婴组在30d时Lachnospiraceae占总菌科的18%，而男婴组中未检测到此菌科。以上结果表明性别对婴儿肠道菌群构成比例有一定的影响，这一早期定植的差异可能与成年后一些相关疾病在不同性别人群间发生的概率有关系。

表3 不同性别婴儿OUT数量及Alpha多样性

(续表3-1)

时间(d) ObseveredSpecies 男女FP Simpson 男女FP160.8±49.2426.20±1.410.8880.4510.39±0.280.36±0.390.0130.9181517.2±3.4216.80±5.520.0110.9240.60±0.040.59±0.030.0420.8513020.63±5.3520.00±4.950.0180.9030.59±0.180.56±0.100.0320.870F2.1462.4081.0550.578P0.1980.2380.4050.613

注：黑色1d；红色15d；蓝色30d。

图4科水平上不同性别婴儿粪便菌群构成比较

Fig.4 Comparison of intestinal flora composition in different gender infants at family level

3讨论

婴儿肠道菌群的定植受多种因素的影响，包括分娩方式、喂养方式、家庭环境等一系列因素。本研究重点考察分娩方式和婴儿性别这两个因素，因此为了排除喂养方式这一重要因素的影响，本研究中选择纯母乳喂养婴儿进行跟踪调查。

3.1不同分娩方式对婴儿肠道菌群的影响

近年来剖宫产比例逐年升高，并高于世界卫生组织规定值(不高于10%～15%)。关于剖宫产的潜在危害多项研究表明它直接导致肠道菌群构成的改变，引起肠道菌失衡，进而导致免疫功能障碍以及增加免疫调节疾病的发生，例如过敏和自身免疫等[21]。众多研究分析了剖宫产婴儿肠道菌群的早期定植情况，以增加更多的证据表明剖宫产对婴儿远期发育的潜在危害。Azad等[22]研究了分娩方式和婴儿饮食对加拿大健康婴儿肠道菌群的影响，结果表明选择剖宫产的婴儿肠道菌群丰度和多样性极低。本研究中alpha多样性分析发现直接表征菌群丰度的Chao1值在顺产组婴儿粪便菌群中高于剖宫产组，同样证实了剖宫产婴儿肠道菌群丰度较低的结论。Dominguez-Bello等[10]的研究发现刚出生时阴道分娩婴儿从母亲的阴道获得更多细菌，以Lactobacillus，Prevotella和Sneathia spp为主，而剖宫产婴儿肠道菌群类似于目前皮肤表面的细菌，以Staphylococcus，Corynbacterium和Propionibac￣terium spp为主。本研究考察了纯母乳喂养婴儿从出生到1月龄时肠道菌群的动态变化过程，结果表明在门水平上不同分娩方式婴儿在同一时期肠道菌群结构差异不显著，均以Firmicutes和Proteobacteria为主。但随着出生时间的变化，科水平上菌群构成丰度差异显著：婴儿出生后1月龄内顺产组婴儿肠道菌群构成多样性高于剖宫产组；Bacteroidaceae在顺产组婴儿肠道菌群中长期存在，且相对丰度较高，而Clostridiaceae在剖宫产组婴儿肠道中稳定存在；Bifidobacteriaceae在顺产组婴儿肠道内出现时间较早(出生后15d)，且顺产组婴儿肠道中此菌相对丰度远高于剖宫产组。Rutayisire等[23]认为出生后3个月内的肠道菌群多样性和定植情况与分娩方式紧密相关，出生6个月后这种显著相关性消失。本研究的局限性在于只分析了分娩方式对出生到1月龄时肠道菌群定植的影响。健康肠道菌群的定植可以促进婴儿免疫系统的正常发育，因此进一步的研究不光需要延长队列跟踪调查时间，还需要结合婴儿的身体发育情况进行综合评价，明确分娩方式对婴儿远期健康的影响。

3.2婴儿性别对肠道菌群的影响

目前关于性别对肠道菌群影响的研究较少，Rutayisire等[23]研究了性别对成年人肠道菌群的影响，结果发现男性与女性肠道菌群的差异受体质指数的影响，且这种差异将会对代谢性疾病和肠道炎症疾病等产生重要影响[24]。因此，性别这一看似并不重要的因素在婴儿期肠道菌群定植时也需重点考虑。本研究发现性别对婴儿肠道菌群多样性和丰度无显著影响，但可造成菌群在科水平上菌群构成的差异：结果表明到出生后1月龄时男婴组中Erysipelotrichaceae相对丰度较高，女婴组中Lachnospiraceae相对丰度较高，且在本研究中这两种菌科在对方组中均未检测到。本研究只是针对性别导致的差异菌进行了分析，后期更多地研究需要进一步研究这种差异菌群的产生对婴儿近期及远期健康的影响，为成年后代谢性等相关疾病的预防或治疗提供数据支撑。

婴儿时期是肠道菌群建立的关键时期，肠道菌群早期定植模式可影响肠道生理发育和免疫系统成熟，进而影响婴儿远期健康。本研究的顺利开展为深入了解婴儿肠道菌群的早期定植奠定了基础，同时为婴幼儿配方奶粉的开发提供了新的着眼点，从微观角度建立一种更科学、更精准的评价体系，从而改变单纯宏观营养组分调配的模拟现状，为新配方的开发提供更合理的数据支撑。

[1]Qin J, Li R, Raes J,etal.A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing[J].Nature,2010,464(7285):59-65.

[2]Ley R E, Peterson D A, Gordon J I.Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine[J].Cell,2006,124(4):837-848.

[3]Suau A, Bonnet R, Sutren M,etal.Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut[J].Appl Environ Microbiol,1999,65(11):4799-4807.

[4]Turnbaugh P J, Ley R E, Hamady M,etal.The human microbiome project: exploring the microbial part of ourselves in a changing world[J].Nature,2007,449(7164):804-810.

[5]Arumugam M, Raes J, Pelletier E,etal.Enterotypes of the human gut microbiome[J].Nature,2011,473(7346):174-180.

[6]Matamoros S, Gras-Leguen C, Le Vacon F,etal.Development of intestinal microbiota in infants and its impact on health[J].Trends Microbiol,2013,21(4):167-173.

[7]〗李方芳.早期益生菌干预对婴儿肠道微生态学变化、生长发育和远期健康影响的研究[D].石家庄:河北医科大学,2014.

[8]Biasucci G, Rubini M, Riboni S,etal.Mode of delivery affects the bacterial community in the newborn gut[J].Early Human Dev,2010,86(Suppl 1):13-15.

[9]Huurre A, Kalliomäki M, Rautava S,etal.Mode of delivery - effects on gut microbiota and humoral immunity[J].Neonatology,2008,93(4):236-240.

[10]Dominguez-Bello M G, Costello E K, Contreras M,etal.Delivery mode shapes the acquisition and structure of the initial microbiota across multiple body habitats in newborns[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(26):11971-11975.

[11]Biasucci G, Benenati B, Morelli L,etal.Cesarean delivery may affect the early biodiversity of intestinal bacteria[J].J Nutr,2008,138(9):1796S-1800S.

[12]Arboleya S, Ang L, Margolles A,etal.Deep 16S rRNA metagenomics and quantitative PCR analyses of the premature infant fecal microbiota[J].Anaerobe,2012,18(3):378-380.

[13]Bolnick D I, Snowberg L K, Hirsch P E,etal.Individual diet has sex-dependent effects on vertebrate gut microbiota[J].Nat Commun,2014,5:4500.

[14]Mueller S, Saunier K, Hanisch C,etal.Differences in fecal microbiota in different European study populations in relation to age, gender, and country: a cross-sectional study[J].Appl Environ Microbiol,2006,72(2):1027-1033.

[15]Stanley E G, Bailey N J C, Bollard M E,etal.Sexual dimorphism in urinary metabolite profiles of Han Wistar rats revealed by nuclear-magnetic-resonance-based metabonomics[J].Anal Biochem,2005,343(2):195-202.

[16]Zhang J, Kobert K, Flouri T,etal.PEAR:a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR[J].Bioinformatics,2014,30(5):614-620.

[17]Vasileiadis S, Puglisi E, Arena M,etal.Soil bacterial diversity screening using single 16S rRNA gene V regions coupled with multi-million read generating sequencing technologies[J].PLoS One,2012,7(8):e42671.

[18]Caporaso J G, Kuczynski J, Stombaugh J,etal.QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J].Nat Methods,2010,7(5):335-336.

[19]Ahn J, Sinha R, Pei Z,etal.Human gut microbiome and risk of colorectal cancer[J].J Natl Cancer Inst,2013,105(24):1907-1911.

[20]Adler C J, Dobney K, Weyrich L S,etal.Sequencing ancient calcified dental plaque shows changes in oral microbiota with dietary shifts of the Neolithic and Industrial revolutions[J].Nat Genet,2013,45(4):450-455.

[21]Miniello V L, Colasanto A, Diaferio L,etal.Mode of delivery and gut microbiota[J].Ital J Pediatr,2014,40(Suppl 2):A17.

[22]Azad M B, Konya T, Maughan H,etal.Gut microbiota of healthy Canadian infants: profiles by mode of delivery and infant diet at 4 months[J].CMAJ,2013,185(5):385-394.

[23]Rutayisire E, Huang K, Liu Y,etal.The mode of delivery affects the diversity and colonization pattern of the gut microbiota during the first year of infants' life: a systematic review[J].BMC Gastroenterol,2016,16(1):86.

[24]Haro C, Rangel-Zúiga O A, Alcalá-Díaz J F,etal.Intestinal microbiota is influenced by gender and body mass index[J].PLoS One,2016,11(5):e0154090.

[专业责任编辑：史晓薇]

Effect of delivery mode and infant gender on intestinal microflora in breast feeding infants

LI Ju-fang1, JIANG Tie-min1, JIA Ni2, HOU Hai-ou3, CHEN Li-jun1, DAI Yao-hua2

(1.BeijingSanyuanFoodsCo.,Ltd,Beijing100163,China; 2.CapitalInstituteofPediatrics,Beijing100020,China;3.TongzhouDistrictMaternalandChildHealthCareHospitalofBeijing,Beijing101100,China)

ObjectiveTo explore the effect of delivery mode and infant gender on intestinal flora colonization in healthy full-term infants within 1 month after birth through gene sequence analysis on 16S rDNA in fecal sample from breast feeding infants by high throughput sequencing technology (Illumina).MethodsTen healthy full-term newborns delivered in obstetrics department of Tongzhou District Maternal and Child Health Care Hospital of Beijing from March to June in 2015 were recruited in this study. The 16SrRNA V3+V4 in fecal samples from exclusively breast feeding infants at 1d, 15d and 30d of age was sequenced by Illimina high throughput sequencing technology.ResultsThe highest flora diversity was found in meconium samples. With extension of feeding time the flora diversity deceased firstly and increased subsequently. Difference in influence on intestinal flora colonization of two delivery modes was significant. Flora diversity in vaginal delivery group was higher than that in cesarean delivery group. In family level Bacteroidaceae in vaginal delivery group could exist for a long time and its relative abundance was higher than that in cesarean delivery group. While Clostridiaceae could survive long and stably in cesarean delivery group. Bifidobacteriaceae had been colonizing since 15 days after birth, but its abundance in vaginal delivery group was far higher than that in cesarean delivery group (the ratio of relative abundance between vaginal and cesarean delivery groups at 15d and 30d was 4:1 and 10:1, respectively). Infant gender had no significant influence on infant intestinal microflora diversity and abundance, but could cause difference in flora composition at family level. Relative abundance of Erysipelotrichaceae was higher in male infants at 30d after birth (its relative abundance accounting for 20% of total bacteria family), and relative abundance of Lachnospiraceae in female infants was higher (its relative abundance accounting for 18% of total bacteria family). And these two bacteria were not detected in the other gender group in this study.ConclusionDelivery mode has distinct influence on intestinal flora colonization rule in infants from birth to 1 month old. Infant gender is not a critical factor of intestinal flora colonization, but it influences intestinal flora composition at some degree during growth and development of infant.

infant; delivery mode; gender; intestinal flora

2016-11-08

北京市科技计划资助项目(D141100004814002)；北京市自然基金资助项目(z140001)；奶牛产业技术体系北京市创新团队资助项目。

李菊芳(1983—)，女，博士，高级工程师，主要从事乳制品开发与临床功效循证研究工作。

戴耀华，研究员。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.09.001

R151.4

A

1673-5293(2017)09-1035-06