菜豆种质资源的植物凝集素含量测定与评价

任三国+陈高+郭瑞

摘 要：以112份菜豆种质商品荚为试验材料，测定了植物凝集素含量，分析评价其遗传变异，扩大极端菜豆凝集素水平的筛查范围。试验结果表明，供试菜豆种质的凝集素均值为0.335 3 mg/g，变幅为0.000 3～1.607 8 mg/g，变异系数为82.26%，种质间水平差异极显著（p<0.01）。研究还表明，供试菜豆植物凝集素含量的种质频率分布曲线呈非连续分布但有明显主峰，有极低和极高水平的种质分布。在已检测的289份资源中，筛选出极低植物凝集素的菜豆材料2份，为低毒菜豆遗传改良提供技术基础。

关键词：菜豆；种质；植物凝集素

中图分类号：S643.1 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2017）16-0036-03

菜豆（Phaseolus vulgaris L.）是人类生活中重要的食用豆类之一，菜豆可分为粒用菜豆和荚用菜豆，2014年全世界普通菜豆籽粒产量为2 500万t，占食用豆总产量的50%左右[1]。食荚菜豆是普通菜豆传入中国后，果荚产生基因突变失去硬质层，并经过长期选择及进化而形成的软荚变种蔬菜作物[2]。食荚菜豆含有丰富的人体所需的营养物质，但含有包括皂苷、胰蛋白酶抑制剂、植酸和植物凝集素[3]等在内的抗营养因子，食用不当会造成人体中毒，中毒后会出现四肢麻木，胃烧灼，头痛、胸闷等神经系统症状，严重者可昏迷，甚至可造成心肾肝多脏器损害或猝死[4]。前期研究曾对56份菜豆种质的4种抗营养因子水平进行差异分析[5]，结果表明，不同菜豆种质抗营养因子水平差异极大；并通过小鼠饲喂实验模型构建[6]，发现菜豆凝集素（Phaseolus vulgaris agglutinin，PHA）是菜豆中的主要内源毒素；因而寻求低水平种质十分关键，故此后又对121份菜豆种质进行凝集素含量水平分析評价[7]。

本研究以未知凝集素水平的112份菜豆种质为材料进行测试，以进一步扩大筛查范围，并结合前期研究，从中筛选出极低凝集素含量的种质，以期再利用其与综合性状如熟性、单株荚数、单荚长、单荚质量等优异品种杂交和回交，达到选育出综合性状优良的低凝集素含量的菜豆品种的目的，为菜豆食用安全和产业发展提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2016年秋季在江汉大学湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心试验大田（位于武汉市蔡甸区永安镇，E 113°47′，N 30°30′）开展了菜豆种质资源比较试验，共计112份食荚菜豆种质参试，编号为1～112。试验采用随机区组设计，重复3次。每个小区10 m×1.6 m，面积为16 m2，株行距0.25 m×0.85 m。试验场地土壤肥力均匀一致，8月20日地膜覆盖播种，栽培管理按照当地常规技术进行。观察农艺性状，10月9日后观察开花结荚情况。选取开花后15 d的鲜荚作为试验材料，从每个品种每个试验小区随机选取若干豆荚（约50 g）作为 1 份样品，共计336份样品，用于植物凝集素含量测定。

1.2 PHA的检测方法

采集的样品材料置于-80℃冰箱低温冰冻，备用。选取健康白兔静脉取血，经胰蛋白酶处理，制备红细胞体积10%的兔子红细胞悬液；取PHA标准品制备1 mg/mL的PHA标准液，倍比稀释6次，加等体积兔子红细胞悬液，酶标法测定吸光度值，绘制标准曲线；称取样品适量（根据所需样品量，即8 g左右为佳）于研钵研磨成浆，以样品∶PBS液=1∶3的比例加入PBS液，4℃摇床振荡浸提4 h，取出用Centrifuge 5804R离心机将菜豆提取液于8 000 r/min、4℃离心20 min，离心制备分离样品上清液作为待测液（3份材料重复操作，得3份待测液）；加等体积兔子红细胞悬液，酶标法测定样品吸光度，代入标准曲线，计算得出菜豆植物凝集素含量。

1.3 数据统计分析方法

试验数据皆通过WPS中Excel表格记录处理。方差分析时，采用完全随机设计，通过DPS 7.05软件分析完成，采用Duncan's 新复极差法分析。

2 结果与分析

2.1 菜豆种质凝集素水平测定结果

112份菜豆种质植物凝集素含量（3次重复均值）如图1所示。结果表明，菜豆凝集素总体含量差异较大，含量最高的为18号（1.607 8 mg/g），最低的是65号（0.000 3 mg/g）。经计算，112份菜豆种质的凝集素含量平均值为0.335 3 mg/g，变异系数为82.26%。

筛选出3份低凝集素含量的种质，分别为65号（0.000 3 mg/g），58号（0.001 5 mg/g）和47号（0.008 2 mg/g）。

2.2 菜豆种质凝集素水平方差分析

对112份菜豆凝集素含量进行方差分析的结果如表1，F值高达7.65（p<0.01），说明供试菜豆群体内种质间豆荚所含菜豆凝集素水平差异极显著。

2.3 菜豆凝集素水平种质频率分布

如112份菜豆植物凝集素含量水平所做的菜豆种质频率分布曲线（图 2）所示，其总体显现非连续性，但主峰明显，近1/3的菜豆种质（35份，占31.25%）凝集素含量分布在均值左右。可见此群体植物凝集素常规水平在0.335 3 mg/g左右，种质间极差很大。极高（1.6 mg/g以上）区域分布有1份种质，极低（0.01 mg/g以下）区域分布有3份种质。

3 小结

本试验以112份菜豆鲜荚为材料，测定其菜豆凝集素水平，结果表明，该种质群体的菜豆凝集素含量均值为0.335 3 mg/g，种质群体内植物凝集素含量变幅为0.000 3～1.607 8 mg/g，变异系数为82.26%，水平差异极显著（p<0.01）。种质频率分布曲线表明，有少量极高菜豆凝集素含量的种质分布和少量极低菜豆凝集素含量的种质分布，并通过比较分析从中筛选出极低植物凝集素水平的菜豆种质3份，根据尚蕊等[5]、任三国等[6]试验，其菜豆凝集素水平极低与极高的品种分别为97-5架豆（0.025 mg/g）、Bean Saint Esprit A Oeil Rouge品种（10.850 mg/g）和zyz-4886 （0.005 mg/g）、SJ-0193 （1.330 mg/g），而本试验筛选得出，极低凝集素含量水平的种质分别为编号65号的SJ-0092（0.000 3 mg/g）、58号的SJ-0082（0.001 5 mg/g）和47号（0.008 2 mg/g），最高凝集素含量水平的菜豆品种为SJ-0053 （1.607 8 mg/g）。考虑综合性状如熟性、单株荚数、单荚长、单荚质量等，结合前期试验已筛选检测的177份种质，在目前检测的289份菜豆种质中，筛选得出极低凝集素含量水平的菜豆种质SJ-0092 和SJ-0082。高凝集素水平方面，未检测出超过Bean Saint Esprit A Oeil Rouge品种的种质。因此，SJ-0092和SJ-0082或可作为低凝集素水平的菜豆亲本，通过与农艺性状优异的菜豆品种杂交和回交育种程序，获得低毒菜豆遗传改良的机会。endprint

参考文献

[1] 朱吉风，武晶，王兰芬，等.菜豆普通细菌性疫病抗性基因定位[J].作物学报，2017，43（1）：1-8.

[2] 王艳，张越，陈姗姗，等.食荚菜豆氨基酸组成与含量及其品质评价[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2014，42（8）：156-161.

[3] Van Damme E M， Peumans W J， Barre A， et al. Plant lectins： a composite of several distinct families of structurally and evolutionary related proteins with diverse biological roles[J]. Critical Reviews in Plant Sciences，1998， 17（6）： 575-692.

[4] 李明，黃涌，梁戈清，等.一起四季豆食物中毒的调查研究 [J].中国卫生监督杂志，1998，5（5）：203.

[5] 尚蕊，吴华，郭瑞，等.不同菜豆品种4种抗营养因子水平差异分析[J].园艺学报，2015，42（11）：2 163-2 173.

[6] 李佳楠，杨薇，彭娜，等.菜豆毒性分析及毒性预测模型建立[J].中国农业科学，2015，48（4）：727-734.

[7] 任三国，陈高，郭瑞，等.121份菜豆品种资源的植物凝集素含量分析[J].江汉大学学报：自然科学版，2016，44（6）：504-508.

Abstract： In order to analyze genetic variability， and select germplasm resources with the extremely low content of lectin， 112 kidney beans were took as materials and their lectin contents were determined. The results showed that the mean value of lectin content， amplitude of changes and coefficients of variation （CV） were 0.335 3 mg/g， 0.000 3-1.607 8 mg/g and 82.26% respectively， and the differences were extremely significant among the materials （p<0.01）. Meanwhile， the frequency distribution curve of 112 kidney beans lectin contens was discontinuous， but there was an obvious peak with long dual-tails， which indicated extremely low or high level of lectin existed in the 112 materials. Furthermore， two materials contained less lectin were screened out from all 289 germplasm resources. The paper provides technical basis for genetic improvement of low toxicity kidney bean.

Key words： Kidney bean； Germplasm resources； Lectinendprint