聚类分析和主成分分析法研究刺玫果指纹图谱

王领弟，杜义龙，杨明宇，臧亚茹，潘海峰*

(1.承德医学院 附属医院 药剂科，河北 承德 067000；2.承德医学院 河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000)

·基础研究·

聚类分析和主成分分析法研究刺玫果指纹图谱

王领弟1，杜义龙2，杨明宇2，臧亚茹1，潘海峰2*

(1.承德医学院 附属医院 药剂科，河北 承德 067000；2.承德医学院 河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000)

目的：研究刺玫果药材的指纹图谱，为其有效质量控制提供参考。方法：采用高效液相色谱法采集18批刺玫果的指纹图谱，通过相似度分析、聚类分析和主成分分析对其进行评价。结果：最终建立了刺玫果的指纹图谱，主要成分得到有效分离，共得到10个共有峰，并确定了4个特征峰的峰归属。样品可被聚成4类，并且3个主成分的累计方差贡献率为73.432%。结论：所建指纹图谱可为刺玫果质量标准的评价提供参考。

刺玫果；指纹图谱；聚类分析；主成分分析

刺玫果RosadavuricaPall.为蔷薇科蔷薇属植物，别名刺木果、山刺玫、刺莓果、野刺玫果，广泛分布于东北、华北等地[1]。主要含有黄酮、有机酸、香豆素等类成分[2-3]。《中药大辞典》记载其健脾消食、活血调经、敛肺止咳[4]。实验表明，刺玫果具有抗衰老、抗癌、抗血栓形成、抗血小板聚集及增强免疫系统功能等作用[5-6]。刺玫果是山玫胶囊的主要原药材之一[7-8]，药材质量直接关乎成品质量。目前，模式识别方法在指纹图谱等多维数据分析中有很大优势，也是其重要的分析手段[9-10]，其中聚类分析与主成分分析法广泛应用于品质鉴定与样品分类研究中[11]。笔者对18批不同产地的刺玫果药材进行高效液相指纹图谱研究，并用相似度分析、聚类分析和主成分分析3种方法对不同产地刺玫果的质量进行评价，为刺玫果的内在质量评价和分类提供依据。

1 仪器与试药

Agilent1100 Series液相色谱仪；对照品没食子酸(批号：110831-200302)、金丝桃苷(批号：111521-200303)、芦丁(批号：100080-200707)和槲皮素(批号：100081-200907)，购于中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。

18批刺玫果药材样品于2014年9月采自各地，由河北承德民族师范学院董建新教授鉴定为蔷薇科蔷薇属植物山刺玫Rosadavurica的成熟干燥果实；样品来源信息见表1。

表1 刺玫果药材来源信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A和B分别为0.5%磷酸水溶液和乙腈；梯度洗脱(0～20 min，5%～10% B；20～30 min，10%～26% B；30～50 min，26%～55% B)；流速为1.0 mL·min-1，柱温为25 ℃，检测波长为365 nm。

2.2 供试品溶液的制备

取刺玫果药材粉末(过6号筛)2 g，精密称定，置索氏提取器中，加60%甲醇水溶液持续提取5 h，浓缩，浓缩液用甲醇完全转移至容量瓶中并定容，离心，取上清液过0.22 μm滤膜滤过，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取没食子酸3.0 mg、芦丁0.4 mg、金丝桃苷3.0 mg和槲皮素0.2 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，即得。

2.4 精密度试验

取S1号刺玫果供试品溶液连续进样6次，进行检测，结果各共有峰相对保留时间的RSD均小于2%，相对峰面积的RSD均小于4%，表明仪器的精密度良好。

2.5 重复性试验

取同一批样品S1号6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样，结果各共有峰相对保留时间的RSD均小于2%，相对峰面积的RSD均小于4%，表明仪器的重复性良好。

2.6 稳定性试验

取S1号供试品溶液连续进样6次，于0、4、8、12、24 h进行检测，结果各共有峰相对保留时间的RSD均小于2%，相对峰面积的RSD均小于4%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 特征图谱的建立

将18批不同来源的刺玫果药材的色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004A版》相似度软件，利用峰面积、峰高以及全谱进行匹配，以S1号样品HPLC指纹图谱为参照图谱，生成对照图谱R，并建立18批刺玫果药材的指纹图谱，见图1。

将刺玫果的图谱数据处理分析后得到其特征图谱，其中有10个共有峰，通过多种对照品比对得知3号峰为没食子酸，6号峰为芦丁，7号峰为金丝桃苷，10号峰为槲皮素，见图2。

注：R.对照品。图1 18批刺玫果指纹图谱叠加图和对照图谱

注：A.混合对照品；B.刺玫果；3.没食子酸；6.芦丁；7.金丝桃苷；10.槲皮素。图2 刺玫果和对照品指纹图谱

2.8刺玫果指纹图谱结果分析

2.8.1 相似度分析 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004A版》，以平均数法(时间窗为0.1)计算各样品与对照图谱的相似度，结果分别为0.986、0.820、0.982、0.994、0.984、0.986、0.988、0.997、0.999、0.988、0.984、0.986、0.983、0.999、0.994、0.996、0.998、0.999。相似度结果表明，18批刺玫果药材有良好的相似性，但仍存在一定差异。

2.8.2 聚类分析 以不同产地刺玫果药材的10个共有峰峰面积为原始数据，运用SPSS19.0统计软件，以平均Euclidean距离为度量标准，采用组间联接的方法对18批刺玫果进行系统聚类分析，结果见图3。当类间距为5～10时，刺玫果药材被分为4大类，Ⅰ类包括S4、S8、S9、S14、S15、S16、S17、S18；Ⅱ类包括S7、S10、S11、S12、S13；Ⅲ类包括S1、S3、S5、S6；Ⅳ类包括S2。

图3 18批刺玫果聚类分析树状图

2.8.3 主成分分析 主成分分析法是一种应用广泛的多元统计方法，用于简化数据，快速实现模式或关系的可视化识别[12]。本文以刺玫果10个共有峰的峰面积为变量，运用SPSS 19.0统计学软件，以主成分的特征值及贡献率为依据进行主成分分析，结果见表2。计算18批刺玫果的主成分得分，得到其主成分得分平面图，见图4。

表2 刺玫果主成分分析特征值

图4 刺玫果主成分分析得分图

3 讨论

本文采用高效液相色谱法建立了刺玫果的指纹图谱，标定出10个共有峰，并根据对照品指认出其中4个，18批刺玫果与对照图谱匹配相似度较高。但因仅凭相似度结果无法准确鉴定刺玫果的产地来源，参考各共有峰之间的差异，本实验再通过聚类分析和主成分分析对18批刺玫果进行统计学分析。其中，聚类分析将不同基原的刺玫果药材分为4大类，如吉林安图、黑龙江伊春和河北承德的刺玫果聚为一类，东北小兴安岭、东北大兴安岭和辽宁葫芦岛的刺玫果聚为一类，安徽亳州产的刺玫果与其他均不能聚为一类，这可能与刺玫果生长环境(产地、气候、土壤等)有关。利用主成分分析，得到了3个主成分，累计方差贡献率为73.432%，其中，第3个主成分经对照品比对得知是没食子酸，其余两个主成分未知，还需结合质谱等手段进一步确定。模式识别中，聚类分析和主成分分析的结果基本一致，并可以与相似度结果相互验证。

本文在前文基础上重新优化了HPLC色谱条件[7]，色谱条件更简单易行。主要侧重用聚类分析和主成分分析法对不同产地刺玫果的质量进行评价，主成分分析能筛选出共有的特征成分，与聚类分析结合使用，发挥各自优势，弥补了单纯用相似度评价指纹图谱的不足，可多角度综合评判刺玫果药材的质量。

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StudyonFingerprintAnalysisofFruitsofRosadavuricabyPrincipalComponentAnalysisandClusterAnalysis

WANGLingdi1，DUYilong2，YANGMingyu2，ZANGYaru1，PANHaifeng2*

(1.Departmentofpharmacy，AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China；2.HebeiKeyLaboratoryofStudyandExploitationofChineseMedicine，ChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China)

Objective：To study the fingerprints of the dried fruits ofRosadavurica，and provide reference for their effective quality control.Methods：The HPLC fingerprints of 18 batches of the dried fruits ofR.davuricawere performed，and subsequently analyzed through the similarity analysis，cluster analysis and principal component analysis.Results：The fingerprints of the dried fruits ofR.davuricawere established，the main components were effectively separated，10 peaks were obtained，and the four characteristic peaks were confirmed.The samples were classified into four groups，and three principal components make up 73.432% of the total variance.Conclusion：The fingerprints provide a reference for the quality standards of the dried fruits ofR.davurica.

Rosadavurica；fingerprint；cluster analysis；principal component analysis

] 潘海峰，教授，研究方向：中药分析及中药质量评价；Tel：(0314)2291186，E-mail：phf2301@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.009

2016-07-06)

*[