左旋龙脑对UVB辐射后小鼠皮肤光损伤的影响△

李小婷，王丹，庞玉新,4*，杨全，范佐旺，马青松，许罗凤

(1.中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737； 2.海南省艾纳香工程技术研究中心，海南 儋州 5717373； 3.广东药学院 中药学院，广东 广州 510006;4.中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700)

·基础研究·

左旋龙脑对UVB辐射后小鼠皮肤光损伤的影响△

李小婷1，2，3，王丹1，2，庞玉新1，2,4*，杨全3，范佐旺1，2，3，马青松1，2，3，许罗凤1，2，3

(1.中国热带农业科学院 热带作物品种资源研究所，海南 儋州 571737； 2.海南省艾纳香工程技术研究中心，海南 儋州 5717373； 3.广东药学院 中药学院，广东 广州 510006;4.中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700)

目的：研究左旋龙脑对中波紫外线(UVB)照射后小鼠皮肤光损伤的影响。方法：通过UVB照射Balb/c小鼠建立光损伤模型，创面外用左旋龙脑，每天1次，连续给药11 d；在伤后不同时相点取材，HE染色观察皮肤组织的病理变化，对皮肤红斑、水肿反应进行评分；测定左旋龙脑对创面愈合时间、组织含水量、8-OHdG、IL-6和NF-κB的影响。结果：与正常组相比，光损伤小鼠红斑、水肿指数明显增加；与模型组相比，左旋龙脑组红斑、水肿指数明显减轻，结痂脱落时间减少，皮肤组织中8-OHdG、IL-6和NF-κB的水平显著降低(P<0.05，P<0.01)；HE染色显示模型小鼠皮肤表皮增厚明显，伴炎性细胞浸润，经左旋龙脑处理后，上述病理改变减轻。结论：左旋龙脑可能通过清除光产物8-OHdG、抑制NF-κB对IL-6的释放的调节作用，使光损伤组织中IL-6下降而起抗炎作用，促进光损伤伤口愈合。

左旋龙脑；紫外线；光损伤；IL-6；NF-κB

皮肤受到290～320 nm的中波紫外线照射可诱发诸多光源性皮肤损伤，例如光老化、皮肤癌、光敏反应和光毒反应、光线性角化等[1]。因此，开发减缓和改善皮肤光损伤的药物就显得尤为重要。艾纳香来源于菊科艾纳香属植物艾纳香Blumeabalsamifera(L.)DC.，是我国著名的黎药和苗药，其主要成分左旋龙脑(L-borneol)有着广泛的生物活性，如抑菌[2]、抗炎、抗血栓、抗肿瘤、修复DNA等[3]，对保护脑组织[4]、调节中枢神经[5]极为有效，然而对其光损伤治疗方面的研究却很少。由于8-羟基脱氧鸟嘌呤核苷(8-OHdG)是UV辐射导致的主要光产物之一，而白细胞介素-6(IL-6)和核转录因子-Kappa B(NF-κB)是紫外损伤的两个重要细胞因子[6]，为了观察左旋龙脑的抗光损伤效果，本实验应用Balb/c小鼠制备光损伤模型，观察左旋龙脑对皮肤组织中8-OHdG、IL-6和NF-κB的影响，为左旋龙脑抗光损伤的研究及其药用价值的开发提供参考。

1 材料与仪器

1.1 动物

Balb/c小鼠(4～6周)，80只，雌性，体重18～22 g，购自湖北省实验动物研究中心，生产许可证：SCXK(鄂)2015-0018。

1.2 药物与试剂

左旋龙脑(Alfa Aesar A Johnson Matthey Company，纯度：98%，批号：10147015)。

小鼠8-OHdG(批号：201505)、IL-6(批号：201505)、NF-κB(批号：201505)ELISA试剂盒，购自北京鑫方程生物技术有限公司；其他相关溶剂均为分析纯，购自西陇化工股份有限公司。

1.3 仪器与设备

TL20W/12RS UVB紫外线灯管(荷兰PHILIPS公司)；UV-340A紫外线照度计(台湾Lutron Electronics公司)；ELX 800酶标仪(美国BioTek公司)；Sartorius CPA225D电子分析天平；DU-800紫外分光光度计(美国Beckman Coulter公司)；TGF-16G型离心机(上海安亭科学仪器厂)；FSH-Ⅱ型高速电动匀浆器(江苏金坛金城国胜实验仪器厂)；RM 2235型手动轮转式切片机(Leica公司)；Axio Imager M2型正置显微镜(Zeiss公司)。

2方法

2.1 模型的建立与分组给药

将小鼠随机分为4组，即空白对照组、模型组、溶剂组(85%乙醇)与左旋龙脑组(以85%乙醇为溶剂稀释左旋龙脑至质量分数为4%)，每组20只动物。参考Chiang-Wen Lee[7]与Lucas Almeida Rigo[8]的研究方法，实验前2 d剪去背部脊柱两侧体表长毛，面积约为3.0 cm×3.0 cm，用8%硫化钠进行脱毛。每次照射前，用改装过的小鼠固定器先固定好小鼠，然后暴露剃毛区，其余非照射部位用防辐射布遮盖。

除空白对照组外，对其余各组小鼠进行以下处理：开启UVB紫外线灯，预热15 min，固定光源距小鼠背部距离约为20 cm，照射时间为40 min，照射强度为0.25 mW·cm-2，辐照量为600 mJ·cm-2；照射期间停止给水给食，照射后0.5 h恢复；照射后30 min起，开始于照射部位均匀涂抹药物125 μL·(10 g)-1[9]。模型组除照射UVB外不作其他处理，溶剂组给予等体积85%乙醇溶液。溶剂组和左旋龙脑组每天给药1次，连续给药11 d。分别于照射后第1、4、7、11 d 4个时相点，每组每次处死4只小鼠，取小鼠背部晒伤处皮肤全层，无菌刀片去除皮下组织。将皮肤组织平均分为3份，分别用于皮肤形态学、组织含水量及炎症因子的检测。

2.2 小鼠皮肤组织病理学观察

切取小鼠照射部位处皮肤组织标本制成石蜡切片，经HE染色后，显微镜下观察皮肤表皮层厚度及炎症细胞情况；采用AxioVision Rel.4.8软件测量皮肤组织表皮层厚度，在表皮层厚度无明显变化处测量4个连续而不重叠的高倍镜视野(×400)下的表皮层厚度，再于同一个高倍镜视野下等间隔测量10处表皮层厚度，取平均值以此作为表皮层厚度的量化指标。

2.3 小鼠皮肤红斑、水肿评分

每天给药1 h后以及再次给药0.5 h前，肉眼观察小鼠背部皮肤照射处的伤口变化，主要为红斑和水肿情况，按表1标准对红斑及水肿情况进行评分。

2.4 小鼠创面结痂脱落时间观察

每天给药1 h后以及再次给药0.5 h前，肉眼观察小鼠背部照射处的伤口变化，包括结痂、皴裂、起皱、脱屑等现象，不断记录，并对小鼠背部脱毛区紫外线照射部位皮肤进行图像采集，直到伤口上的焦痂脱落，将结痂完全脱落的时间记为小鼠创面结痂脱落时间。

2.5 小鼠背部皮肤组织含水量测定

每只小鼠取相同部位照射处皮肤，约100 mg，用滤纸吸干血液，以电子天平称湿质量。然后放于80 ℃烤箱烘烤24 h，取出称干质量，干湿法计算皮肤组织含水量。计算公式如下：

2.6 ELISA法检测小鼠皮肤组织中8-OHdG、IL-6和NF-κB含量

取照射处皮肤约100 mg，滤纸吸去血迹，称重，放入0.9%氯化钠溶液中，按100 mg组织加1 mL 0.9%氯化钠溶液的比例碾磨制成匀浆。4 ℃，10 000 r·min-1条件下离心15 min，将离心好的匀浆留上清液丢弃沉淀，置于-80 ℃保存。采用ELISA法检测皮肤组织上清液中8-OHdG、IL-6和NF-κB的含量，具体操作步骤按试剂盒说明书要求进行。

2.7 数据统计分析

3 结果

3.1 左旋龙脑对光损伤小鼠皮肤组织病理学的影响

空白对照组的小鼠皮肤表皮层较薄，细胞分层清晰，细胞成分及数量适中。与空白组比较，模型组小鼠表皮层厚度显著增加(P<0.01)，细胞分层不清；胞质嗜伊红色，核固缩、变形；真皮层偶见中性粒细胞浸润等现象。与模型组、溶剂组比较，左旋龙脑组在给药7 d后显著抑制紫外线损伤所致小鼠表皮角质化与浸润，表皮层厚度显著降低(P<0.01)，见图1、表2。

注：黑色箭头代表表皮层厚度。图1 左旋龙脑对光损伤小鼠皮肤组织病理学的影响(×400)

组别表皮层厚度/μm1d4d7d11d空白对照组21.32±3.4422.65±2.2020.43±3.4521.61±2.56模型组121.21±7.28##109.58±11.61##103.05±9.00##90.69±7.10##溶剂组116.45±4.82103.67±6.9996.48±3.43*74.20±5.92**左旋龙脑组98.96±6.89**DD88.97±7.07**DD49.39±7.73**DD34.08±3.68**DD

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与溶剂组比较，P<0.05，P<0.01；下同。

3.2 左旋龙脑对光损伤小鼠皮肤红斑、水肿评分的影响

与空白对照组比较，模型组红斑与水肿评分均显著增加(P<0.01)，提示造模成功；在整个观察过程中，皮肤红斑及水肿评分呈现先升后降趋势，至4 d时达到峰值，之后评分逐渐下降，提示此时皮肤的损伤程度在逐渐恢复，左旋龙脑可在一定程度上改善皮肤的红斑与水肿情况。在11 d时尤为明显，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，见图2。

注：与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与溶剂组比较，P<0.05，P<0.01；下同。图2 各处理组不同时相点红斑、水肿评分

3.3 左旋龙脑对光损伤小鼠创面结痂脱落时间的影响

空白对照组小鼠皮肤光滑细腻，未见明显病理性变化；与空白对照组比较，模型组和溶剂组小鼠背部脱毛处皮肤出现结痂、皴裂、起皱等现象，去表皮后创面呈浅红或红白相间；左旋龙脑组结痂面积逐渐缩小，结痂脱落平均时间为8 d，明显快于模型组、溶剂组。提示左旋龙脑可加速伤口结痂脱落，促进新皮形成，从而促进光损伤创面的修复，见图3、4。

图3 左旋龙脑对光损伤小鼠创面结痂脱落时间的影响

3.4 左旋龙脑对光损伤小鼠皮肤创面组织含水量的影响

紫外线照射后，模型组创面组织含水量均低于空白对照组，至第11 d，模型组创面组织含水量与空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组、溶剂组比较，左旋龙脑组皮肤创面组织含水量显著增加(P<0.05，P<0.01)，提示左旋龙脑抵抗紫外损伤的作用与减少皮肤水分流失有关，见表3。

3.5 左旋龙脑对光损伤小鼠皮肤组织中8-OHdG的影响

在整个观察周期中，除空白对照组处于稳定值外，其他3组8-OHdG含量总体呈上升趋势。与空白对照组比较，模型组8-OHdG含量显著升高(P<0.01)，而在第1、2、4、7、11天 5个时相点，左旋龙脑组8-OHdG含量均显著低于模型组和溶剂组(P<0.05，P<0.01)，表明左旋龙脑在光损伤后能够有效减少皮肤中光产物8-OHdG的堆积，见表4。

图4 左旋龙脑对光损伤小鼠创面愈合的影响

组别创面组织含水量(%)1d2d4d7d11d空白对照组63.32±5.8762.10±7.0461.16±0.6460.65±3.6161.38±3.09模型组62.04±6.6558.36±5.9257.85±6.7357.48±3.0456.17±3.32#溶剂组65.85±2.6363.95±5.7961.83±4.7160.44±6.2758.41±0.69左旋龙脑组68.40±3.14*67.39±4.59*73.13±3.34**DD68.71±2.74**DD69.29±5.10**DD

表4 伤后不同时相点各组皮肤组织中8-OHdG水平的比较

3.6左旋龙脑对光损伤小鼠皮肤组织中IL-6的影响

照射后前2 d，与空白对照组相比，模型组IL-6表达显著增加(P<0.01)；随着时间延续，各组IL-6含量逐渐降低，第4 d起，模型组与空白组间IL-6含量已无统计学差异(P>0.05)；以左旋龙脑处理后，IL-6含量显著降低，与模型组、溶剂组比较差异均具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)(见表5)，提示左旋龙脑可增强光损伤机体抑制炎症因子释放的能力。

表5 伤后不同时相点各组皮肤组织中IL-6水平的比较

3.7 左旋龙脑对光损伤小鼠皮肤组织中NF-κB的影响

在光损伤初期，各组组织中NF-κB水平差异较大，随着时间延续，各组小鼠皮肤NF-κB水平呈下降趋势，且差异变小；与空白对照组比较，模型组NF-κB水平显著升高(P<0.01)；前4 d左旋龙脑组NF-κB水平下降，与模型组和溶剂组比较差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，提示左旋龙脑在光损伤早期对NF-κB抑制作用明显，见表6。

表6 伤后不同时相点各组皮肤组织中NF-κB水平的比较

4 讨论

紫外线诱导的光损伤是造成皮肤疾病的重要因素[10]。本实验采用Balb/c小鼠光损伤模型，研究左旋龙脑抵抗光损伤的效果，实验结果显示，左旋龙脑能显著抑制UVB诱导表皮增厚与炎性细胞浸润，加速光损伤创面结痂脱落，促进伤口愈合，减少发红、干燥、脱屑、含水量减少等现象。研究结果表明，左旋龙脑能够促进光损伤修复。另外，UVB辐射有一定的促细胞肿胀作用[11]，这是UVB辐射引起皮肤炎症产生的可能机制之一，左旋龙脑处理后表皮层厚度显著减少从而降低炎症发生。

8-OHdG是UVB损伤皮肤细胞DNA而产生的主要光产物之一，反映了整个机体平均的氧化损伤率及体内DNA氧化损伤与机体正常的修复作用[12]。IL-6是一种炎性细胞因子，具有广泛的生物学活性，作为角质形成细胞-成纤维细胞相互作用环路中的重要中介物质[13]，参与UVB诱导角质形成细胞凋亡的机制，与UV辐射引起的炎症反应密切相关。当受到UV等外来因素刺激时，可诱导包括自身在内的多种细胞因子(IL-1，TNF-α)以及一些炎症介质的产生，形成恶性循环，损伤组织，继而加重炎症反应[14]。NF-κB是一种与炎症有关的核转录因子，在细胞中通常以非活性的状态存在，当接受UV和炎症因子刺激后，活化的NF-κB转入巨噬细胞核中，调高炎症介质的转录，使炎症因子的合成和释放增加，加重炎症反应[15]。UVB辐射对角质形成细胞NF-κB的激活主要是通过胞浆IКB-α蛋白(Kappa B抑制蛋白)降解来实现的[16]。在静息状态下，NF-κB与其抑制剂IКB-α蛋白以无活性的复合物形式存在，当受到UV刺激时，通过激活一系列激酶使IКB-α磷酸化从而使NF-κB与IКB-α发生解离，UV辐射活化NF-κB刺激前炎症因子，诱导产生的细胞因子通过细胞表面细胞因子受体活化，从而放大UV效应，进一步加剧细胞受损[17-18]。

本实验中，与空白对照组比较，模型组中8-OHdG显著增加，而左旋龙脑组与模型组比较8-OHdG明显降低，这说明左旋龙脑能明显降低光损伤小鼠皮肤的8-OHdG水平。有文献报道[19]，UVB辐射诱导的DNA损伤可造成额外的炎症压力，进一步加重皮肤损伤。由此可见，左旋龙脑减少DNA损伤光产物产量的特性在一定程度上加强了其抗炎作用。本研究结果显示，与模型组比较，左旋龙脑组IL-6、NF-κB均显著降低，这说明随着8-OHdG的减少，IL-6生成和释放减少，IL-6的减少使对NF-κB的激活度减弱，抑制了NF-κB的核转位，使NF-κB活化水平下调，NF-κB的表达亦随之下降，这在一定程度上抑制了IL-6对自身的正向调控作用，使IL-6的生成量降低，从而减轻炎症反应。因此认为左旋龙脑可能通过修复DNA损伤、减少光产物8-OHdG积累、抑制NF-κB对IL-6释放的调节作用，使光损伤组织中IL-6下降从而减少光损伤发生，促进伤口愈合。

[1] Chiang H M，Chan S Y，Chu Y，et al.Fisetin ameliorated photodamage by suppressing the mitogen-Activated protein kinase/matrix metalloproteinase pathway and nuclear factor-κB pathways [J].J Agr Food Chem，2015，63(18)：4551-4560.

[2] Ragasa C Y，Kristin C.Co A L，Rideout J A.Antifungal metabolites fromBlumeabalsamifera[J].Nat Prod Res，2005，19(3)：231-237.

[3] Pang Y，Wang D，Fan Z，et al.Blumeabalsamifera--a phytochemical and pharmacological review [J].Molecules，2014，19(7)：9453-9477.

[4] Hur J，Pak S C，Koo B S，et al.Borneol alleviates oxidative stress via upregulation of Nrf2 and Bcl-2 in SH-SY5Y cells[J].Pharm Biol，2013，51(1)：30-35.

[5] 陈瑞玉，李伟荣，宓穗卿，等.天然冰片及其结构修饰物对惊厥模型小鼠氨基酸类神经递质的影响[J].中药新药与临床药理，2011，22(3)：282-285.

[6] Zhao J G，Zhang Y Q.Inhibition of the flavonoid extract from silkworm cocoons on DMBA/UVB-induced skin damage and tumor promotion in BALB/c mice [J].Toxicol Res，2015，4(4)：1016-1024.

[7] Lee C W，Ko H H，Lin C C，et al.Artocarpin attenuates ultraviolet B-induced skin damage in hairless mice by antioxidant and anti-inflammatory effect [J].Food Chem Toxicol，2013，60：123-129.

[8] Rigo L A，da Silva C R，de Oliveira S M，et al.Nanoencapsulation of rice bran oil increases its protective effects against UVB radiation-induced skin injury in mice[J].Eur J Pharm Biopharm，2015，93：11-17.

[9] Rodríguez-Yanes E，Juarranz，Cuevas J，et al.Polypodium leucotomos decreases UV-induced epidermal cell proliferation and enhances p53 expression and plasma antioxidant capacity in hairless mice [J].Exp Dermatol，2012，21(8)：638-640.

[10] Mukhtar H，Elmets C A.Photocarcinogenesis：mechanisms，models and human health implications：introduction [J].Photochem Photobiol，1996，63(4)：356-357.

[11] González S，Astner S，An W，et al.Dietary lutein/zeaxanthin decreases ultraviolet B-induced epidermal hyperproliferation and acute inflammation in hairless mice [J].J Invest Dermatol，2003，121(2)：399-405.

[12] Kopec R E，Schick J，Tober K L，et al.Consumption of a tomato carotenoid containing diet reduces UV-induced inflammation and DNA damage in a Skh-1 hairless mouse model [J].FASEB J，2011，25：975-1019.

[13] Schreck R，Albermann K A J，Baeuerle P A.Nuclear factor kB：an oxidative stress-responsive transcription factor of eukaryotic cells(a review)[J].Free Radical Res Commun，1992，17(4)：221-237.

[14] 王业秋，陈巧云，李建民，等.绿原酸对紫外线损伤的HaCaT细胞肿瘤坏死因子α和白细胞介素6表达的调节[J].中国药理学与毒理学杂志，2014，28(1)：63-67.

[15] Rosette C，Karin M.Ultraviolet light and osmotic stress：activation of the JNK cascade through multiple growth factor and cytokine receptors [J].Science，1996，274(5290)：1194-1197.

[16] Khandelwal A R，Anandharaj A，Oleksandr E，et al.Curcumin C3®prevents ultraviolet B radiation-induced acute damage in JB6 keratinocytes and mouse skin via FGF-2/mTOR/NF-κB pathway [J].Cancer Res，2015，75(15)：4644.

[17] McNulty S E，Tohidian N B，Meyskens F L.RelA，p50 and inhibitor of kappa B alpha are elevated in human metastatic melanoma cells and respond aberrantly to ultraviolet light B[J].Pigm Cell Res，2001，14(6)：456-465.

[18] Xia X，Park E，Fischer S M，et al.Mouse genetic models reveal surprising fungtions of4IkB kinase alpha in skin development and skin carcinogenesis [J].Cancers，2013，5(1)：170-183.

[19] 许阳，周炳荣，骆丹.黄芩苷对中波紫外线辐射后小鼠皮肤氧化应激及DNA损伤的影响[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2011，10(6)：343-345.

EeffectsofL-borneolonUVB-inducedPhoto-damagesinSkinofBalb/cMice

LIXiaoting1，2，3，WANGDan1，2，PANGYuxin1，2,4*，YANGQuan3，FANZuowang1，2，3，MAQingsong1，2，3，XULuofeng1，2，3

(1.TropicalcropsGeneticResourcesInstitute，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences，Danzhou571737，China； 2.HainanProvincialEngineeringResearchCenterforBlumeaBalsamifera，Danzhou571737，China； 3.SchoolofTraditionalChineseMedicine，GuangDongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510006，China; 4.NationalResourceCenterforChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)

Objective：To study effects ofL-borneol on interleukin-6(IL-6)and nuclear factor kappa-B(NF-κB)in UVB irradiation-induced mice.Methods：Eighty of Balb/c mice were randomly divided into four groups.Photo-damaged mouse model was established by UVB irradiation.L-borneol was adopted for wounds once every day for 11 days.The pathological changes of the photo-damaged skin tissue were observed by HE staining.Samples were collected at different time points after UVB irradiation to assess healing time，tissues water content，erythema and edema.The levels of 8-hydroxy-desoxyguanosine(8-OHdG)，IL-6 and NF-κB in the epidermis were detected by ELISA.Results：Compared with the normal group，the erythema and edema indexes increased significantly in the UVB model group.The erythema and edema indexes，IL-6 and NF-κB levels in mice with acute UVB exposure significantly reduced after treatment withL-borneol.Further more，HE staining showed that UVB irradiation induced keratinocyte hyperplasia，sunburn cell formation and inflammatory cell infiltration.After treatment withL-borneol，these histological abnormalities were alleviated.In addition，the topical application ofL-borneol resulted in a significant decrease in UVB-induced increases of epidermis thickness，especially depressing in UVB mediated generation of 8-OHdG(P<0.05，P<0.01).Conclusion：It is considered thatL-borneol could alleviate the symptoms of photo-damages by UVB irradiation.One principle of the effects could be thatL-borneol removed of light products 8-OHdG，than controlled NF-κB regulation on release of IL-6 and lead to fall of IL-6 level in photo-damaged tissue causing role of anti-photo-damage.

L-borneol；ultraviolet B；photo-damage；IL-6；NF-κB

科技部科研院所技术开发研究专项(2013EG134239)；贵州省重大科技专项计划项目(6011-2013)

] 庞玉新，研究员，博士，研究方向：南药资源研究与开发；Tel：(0898)23300268，E-mail：blumeachina@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.010

2016-06-05)

*[