HPLC测定脑康冲剂中羟基红花黄色素A的含量

郝玉英，菅艳艳

1.包头市中心医院药学处，内蒙古包头 014040；2.包头市食品药品检验检测中心，内蒙古包头 014030

HPLC测定脑康冲剂中羟基红花黄色素A的含量

郝玉英1，菅艳艳2

1.包头市中心医院药学处，内蒙古包头 014040；2.包头市食品药品检验检测中心，内蒙古包头 014030

目的 建立HPLC测定脑康冲剂中羟基红花黄色素A含量的方法。 方法 选择该院药房2014年3月—2016年3月期间收集的脑康冲剂作为该次研究的调查对象，而后予以HPLC进行测定，填充剂以及流动相分别为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱和乙腈-0.7%磷酸溶液，检测波长为403.0 nm，最后对检测结果进行总结。 结果 羟基红花黄色素A在0.075～1.869 μg范围内线性关系良好，回归方程为：Y=7 110.467+3 689 880X r2=1。结论 该HPLC测定方法具有较强的专属性和重现性，对羟基红花黄色素A无任何影响，可用于脑康冲剂的质量控制。

脑康冲剂；羟基红花黄色素A；HPLC

脑康冲剂为该院在临床使用五年以上的经验方，具有悠久的历史与可靠的疗效，处方由黄芪、当归、川芎、红花等12味中药组成，它的功效是活血化瘀、散瘀通经络，用于脑出血、脑外伤、脑梗死患者恢复期使用[1-3]。据相关资料显示，红花的主要构成为：黄酮类化合物、色素以及脂肪酸，同时还包括挥发油和多炔等。近年来，医疗技术日新月异的发展，HPLC测定法应运而生，并取得了临床的高度认可广泛应用[4]。与此同时，该检测方测定羟基红花黄色素A具有多种优势，如具有较高的专属性和重现性。鉴于此，该次实验为探究该检测方法的临床价值，选择该院药房2014年3月—2016年3月期间收集的脑康冲剂进行分析，现将研究过程和结果进行如下汇报。

1 使用仪器和试剂

使用仪器：该次研究中的检测器型号为SPD-10Avp型，泵型号为C—10ATvp。同时配合电子天平和紫外分光光度仪。使用试剂：该次研究中的使用试剂为羟基红花黄色素 A，包头市中心医院提供脑康冲剂胶囊 （批号：20120605、20130910、20140102）；准备自制的模拟样品、高纯度的水、色谱纯以及分析纯[5]。

2 研究方法

2.1 色谱参数

该次研究中将十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱填充剂，phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）为该仪器的型号。

2.2 流动相

依据《中国药典》选择适宜的流动相，即：甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液，同时选择适宜的测定方法。值得注意的是，该次研究所提供的基红花黄色素A分具有较高的理论板数和分离度，保留时间良好，因此符合检测流动相的相关标准。

2.3 柱温：室温

选择适宜的检测波长：检测波长的选择：选取羟基红花黄色素A，而后对其精密称取，而后选择甲醇，浓度为25%，将其制成溶液，确保1 mL含40 μg，波长扫描范围需合理选择，正常参数为300～500 nm之间。最后依据《中国药典》对羟基红花黄色素A的测定方法进行规范，检测波长参数为404 nm，结果表明，检测波长参数404 nm时，羟基红花黄色素A吸收显著[6-8]。明确理论板数：据大量研究表明，理论板数超过3 500，羟基红花黄色素A具有较高的分离度，但是，由于理论版数的不同，使用的色谱柱也存在差异性，因此，在明确理论板数时，羟基红花黄色素A峰不得在2 500以下。

2.4 溶剂的提取以及结果分析

选择适宜的溶液：通过查阅《中国药典》可知，溶剂的提取选择甲醇，且浓度为25%。考察提取效率：提取液选择浓度为25%的甲醇，使用剂量为50 mL，在超声引导下进行提取，功率参数和频率参数分别为300 W、50 kHz。要想被测成分完全提出得以保证，需选择合理的考察时间，超声提取时间为30、40 min以及50 min时，最后分析提取效率对羟基红花黄色素A含量的影响。结果显示：羟基红花黄色素A的含量在超声提取30、40 min以及50 min时，含量未发生任何变化，因此临床选择40 min作为提取时间。提取溶剂加入量结果分析：提取溶剂为25 mL时，会降低样品羟基红花黄色素A的含量，而提取溶剂为50、75 mL时，样品羟基红花黄色素A含量雷同，未发生变化，且提取效果显著，因此，50 mL作为提取溶剂的加入量。

2.5 专属性

选择适量羟基红花黄色素A作为对照品溶液，称定时需确保精密，而后加入浓度为25%的甲醇，最后制成的样品确保每1 mL含30 ug溶液。选取2 g该品的粉末制备称供试品，待精密称量后在塞锥形瓶中放置，与此同时，将50 mL甲醇加入其中，浓度为25%，对其整体重量进行称定。待上述操作完成后进行超声处理，功率参数和频率参数分别为300 W、50 kHz，时间为40 min，在低温度下保存，而后再次对重量进行称定，减失的重量会用甲醇进行补足，最后进行摇匀和过滤[9-11]。阴性对照供试品选择雷同制备工艺进行，阴性对照溶液方法以供试品的方法为主，在以上叙述的色谱条件下，对对照品溶液、供试品溶液以及阴性对照溶液进行选取，剂量均为20 uL，在液相色谱仪中将上述3种溶液分别注入，检测结果显示：阴性对照组色谱图结果同对照品和供试品进行比对，在相应的保留时间处色谱峰均未出现，由上述结果可知，阴性对照组溶液不会影响羟基红花黄色素A。

2.6 线性关系分析

选择适宜的羟基红花黄色素A对照品，待完成精密称量后，将25%甲醇加入其中，确保制成的样品每1 mL含0.3 mg的溶液，将其充当对照品溶液；而后对上述制成的溶液进行精密量取，剂量分别为0.6 mg、1.2、2.4、3、6 mL以及15mL，待量取完成后在25mL的量瓶中分别置入，随后将甲醇加入其中，直至达到刻度线为止，充分摇匀。在色谱仪中加入精密吸取10 μL溶液，而后对其进行检测，回归分析峰面积和浓度的相关性，检测结果表明：在0.075～1.869 μg范围内，线性关系良好，回归方程为：Y= 7 110.467+3 689 880X r2=1。除此之外，另选同一份供试品溶液，测定时间分别为0、2、6、10 h以及12 h。结果表明：12 h内，羟基红花黄色素A的峰面积积分值稳定性较好。

2.7 精密度及准确度

选取批号相同的样品进行重复性试验，研细，取6份，供试品的选取剂量为10 μL，而后在液相色谱仪中注入，对每份样品的含量进行测定，计算方法依据外标法。精密称量供试品9份，剂量均为1 g，在9个具塞锥形瓶中分别置入，随后均分3组，每组样品各3份，在此期间，将羟基红花黄色素A对照品溶液加入其中，浓度需确保0.311 5 mg/mL，使用剂量分别为2、3 mL以及4 mL，与此同，将48、47、46 mL的甲醇溶液也加入其中，测定每份含量，计算回收率。

3 测定样品

对3批样品的含量进行测量，与此同时，对同批的模拟样品进行测量。前者的批号分别为 20120605、20130 910、20140102，后者的批号为20150301。

4 结果

羟基红花黄色素A对照品溶液利用流动相进行配置，而后使用紫外可见分光光度计进行吸光度扫描，波长参数在200～50 nm之间，结果显示：在226 nm处和402 cm处可见两个吸收峰，如图1、图2。由此可见，检测波长参数为226 nm时，杂质干扰相对严重，检测波长参数为402 nm时，杂质峰相对较少，无任何干扰，具有较高的灵敏度，因此检测波长选择402 nm。

选取羟基红花黄色素A，而后对上述制成的溶液进行精密量取，剂量分别为 0.10、0.25、0.50、1.00 mL以及2.00 mL，待量取完成后在5 mL的量瓶中分别置入，对其进行分离和检测。结果显示：羟基红花黄色素A在0.075～1.869 μg范围内线性关系良好，回归方程为：Y=7 110.467+ 3 689 880X r2=1。

图1 可见吸收广谱

图2 对照品与样品的色谱图

5 结论

脑康冲剂的主要成分为红花、枸杞、枳实，还包括当归以及川芎等，该药物可以起到填精益髓和补肾养血的作用，在老年痴呆、血管痴呆、小儿脑瘫以及脑血管病中较为适用。红花为菊科红花属植物红花的干燥花，属于新兴的油料作物，不仅可以活血痛经，同时可以祛瘀止痛。与此用时红花可以将心脑血管病的血液流变参数予以改善，心肌可以得到保护，同时将患者的心功能有效改善。除此之外，红花可以调节细胞内外钙离子，对血管内皮细胞的凋亡和坏死进行预防。近年来，种植面积的不断增加，产量也逐年提升，在天然食用色素和保健食品中大量红花被应用，据现代药理学结果显示，红花可以通过清除氧自由基而减轻实验性脑缺血再灌注损伤，且其具有抗凝血、血栓形成的作用，与此同时，红花具有降血压和降血脂的作用。尤其在脑血管疾病方面具有显著的效果。近期研究表明[11]，红花的主要成分为羟基红花黄色素A，且测定方法主要为两种，一种为分光光度法，另一种为感官评定法，但是对其功效成分含量的测定研究少之又少。有学者利用高效液相色谱法对红花中黄色素的含量进行测定，结果表明，3个产地红花中的羟基红花黄色素A和红花黄色素A占黄色素总量的88%。从该次研究结果结果可以发现，羟基红花黄色素A在0.075～1.869 μg范围内线性关系良好，回归方程为：Y=7 110.467+3 689 880X r2=1，而在Tian-xue等专家[12]的研究中，羟基红花黄色素A在0.278～1.528 μg范围内线性关系良好，对应回归方程为：Y=4 220 000X-52 200，r=0.999 6，这一研究结果与该次研究结果基本一致。与此同时，红花黄色素A药理活性较强，其中含量最高的为羟基红花黄色素。

通过HPLC测定可知，该方法具有较强的专属性和重现性，对羟基红花黄色素A无任何影响，可用于脑康冲剂的质量控制。

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HPLC in Measuring the Content of Hydroxysafflor Yellow A in the Naokang Instant Granules

HAO Yu-ying1,JIAN Yan-yan2
1.Department of Pharmacy,Baotou Central Hospital,Baotou,Inner Mongolia,014040 China；2.Baotou Food and Drug Inspection and Testing Center,Baotou,Inner Mongolia,014030 China

Objective To establish a method of HPLC in measuring the content of hydroxysafflor yellow A in the naokang instant granules.Methods The naokang instant granules collected in our hospital from March 2014 to March 2016 were selected and measured by the HPLC,and the filler and mobile phase were respectively octadecylsilane chemically bonded silica and acetonitrile-0.7%phosphoric acid solution and the detection wavelength was 403.0 nm,and finally the test results were summarized.Results The liner relationship of hydroxysafflor yellow A in the 0.075～1.869 μg was good,and the regression equation was Y=7 110.467+3 689 880X r2=1. Conclusion The specificity and reproducibility of the HPLC measurement method are strong,which has no effect on the hydroxysafflor yellow A and it can be used as the quality control of naokang instant granules.

Naokang instant granules;Hydroxysafflor yellow A;HPLC

R927

A doi10.11966/j.issn.2095-994X.2017.03.02.13

2017-03-10；

2017-03-25

郝玉英（1971-），女，内蒙古包头人，本科，副主任药师，研究方向：医院制剂的研发。