菌株Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans SL-205的反硝化特性

张树松,樊月婷,孙兴滨,仇天雷,高 敏,王旭明,3*(.东北林业大学生命科学学院,哈尔滨 50040；.北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心,北京 00097；3.农业部都市农业(北方)重点实验室,北京 00097)

环境微生物

菌株Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans SL-205的反硝化特性

张树松1,2,樊月婷1,2,孙兴滨1,仇天雷2,高 敏2,王旭明2,3*(1.东北林业大学生命科学学院,哈尔滨 150040；2.北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心,北京 100097；3.农业部都市农业(北方)重点实验室,北京 100097)

为强化硝酸盐污染水的反硝化脱氮,研究了反硝化新菌株Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans SL-205T利用不同碳源的缺氧反硝化性能,以及利用固体碳源聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)的好氧反硝化特性.结果表明,在缺氧状态下,菌株 SL-205T分别以乙酸钠、琥珀酸钠和 PHBV为唯一碳源时,硝酸盐去除率均达到 99%以上;当初始硝态氮浓度为 315mg/L 时,PHBV的最适投加量为 2.0g/L.菌株SL-205T能利用PHBV进行好氧反硝化,当反应进行到36h时,硝酸盐去除率达到94.54%,平均反硝化速率为8.69mg/(L·h),并且在反应结束时没有亚硝酸盐和氧化亚氮的积累.以上结果为该菌株在废水脱氮处理中的应用奠定了实验基础.

Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans SL-205T；硝酸盐；碳源；聚羟基丁酸戊酸共聚酯；好氧反硝化

近些年,由于人类活动,如工农业生产和城镇生活污水处理等大量含氮废水的排放,导致地下水及地表水中硝酸盐浓度明显升高[1].过高的硝酸盐含量会造成水体富营养化[2-3],水体中的溶解氧降低,使水生动物处于缺氧状态甚至死亡,对自然生态造成巨大影响[4].同时也可以使地表水中藻类大量繁殖,不仅严重影响水体观感,而且这些含藻水进入到城市供水系统中会增加水处理工艺的难度和成本[5-6].饮用水中硝酸盐浓度过高时,会大大增加饮用者患高铁血红蛋白血症和胃癌的风险[7-8].在水产养殖中氮素污染也是主要危害之一,氮素含量过高使水生动物失去平衡能力、厌食、动作迟缓,甚至死亡[9].

利用微生物的反硝化作用去除硝酸盐是一种常规的污水脱氮工艺,对于低C/N比的硝酸盐污染水,需要向其提供碳源以满足反硝化所需的电子供体[10].常规反硝化工艺通常加入甲醇、葡萄糖、醋酸钠等可溶性有机物作为补充碳源[11-12],但存在可溶性碳源容易过量的风险,而且系统运行和维护比较困难,碳源投加量不易控制[13].为避免常规可溶性碳源的弊端,可采用非水溶性固体有机物作为反硝化微生物的碳源. Ovez等[14]利用甘草等作为生物反硝化的碳源和生物载体去除水源水中的硝酸盐,去除率达到了 100%;邵留等[15]在以稻草为碳源的实验中发现,稻草的浸出液中含有大量的微量元素,这些微量元素有利于提高反硝化菌等相关菌体的活性,并提高反硝化速率.除了天然纤维素类物质的使用,近年来,人工合成可生物降解聚合物(BDPs)因其良好的生物相容性和生物降解性越来越受到研究者的关注.Boley等[16]利用聚己内酯(PCL)等可降解聚合物作为碳源和生物膜载体,实现了循化水产养殖系统中硝酸盐的有效去除.赖才胜等[17]以聚丁二酸丁二醇酯(PBS)作为固体碳源,利用响应曲面法考察进水硝酸盐浓度和水力停留时间对脱氮效率的影响,并建立了脱氮效果的预测模型.与常规反硝化工艺相比,固体碳源反硝化工艺不需要复杂的碳源投加控制系统,操作简单,运行稳定[13].

目前,对于固体碳源反硝化的研究主要采用活性污泥作为接种物,以去除污染水中的硝酸盐.利用纯菌进行固体碳源反硝化的研究还鲜有报道.课题组前期分离到一株能降解聚羟基丁酸戊酸共聚酯[poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate), PHBV]的反硝化细菌 SL-205T菌株,经鉴定为Diaphorobacter属的一个新种,并命名为 D. polyhydroxybutyrativorans[18].本文首次研究了该菌种的模式菌株SL-205T利用固体碳源PHBV的反硝化性能,以期为该菌种在生物脱氮领域的应用奠定基础.

1 材料与方法

1.1 实验菌株

Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans SL-205T:本实验室分离自以 PHBV为碳源的反硝化反应器,在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的保藏编号为 CGMCC No.6625.菌株 SL-205T于 50%甘油中-80℃保存,使用前在LB培养基中活化2次(28℃).

1.2 培养基

蛋白胨液体培养基(LB):蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L,,NaCl 10.0g/L,pH 7.2-7.4.

反硝化培养基:MgSO4·7H2O 0.2g/L, KNO31.0g/L,K2HPO41.0g/L,PHBV粉末(宁波天安生物科技有限公司)2.0g/L,微量元素溶液 2mL,pH 7.0-7.2.在研究可溶性碳源的反硝化作用时,分别用6.287g乙酸钠、4.529g柠檬酸钠和3.744g琥珀酸钠代替上述培养基中的 PHBV,使培养基的C/N=8.微量元素溶液:EDTA 50.0g/L,ZnSO42.2g/L,CaCl25.5g/L,MnCl2·4H2O 5.06g/L, FeSO4·7H2O 5.0g/L,(NH4)6Mo7O2·4H2O 1.1g/L, CuSO4·5H2O 1.57g/L,CoCl2·6H2O 1.61g/L以上培养基在0.11MPa,121℃下灭菌20min后备用.

1.3 反硝化性能测定

缺氧反硝化:将 80mL的反硝化培养基装入150mL血清瓶中,通入高纯氦气后用胶塞密封、灭菌.用一次性无菌注射器按 2%(V:V)的接种量将活化的菌株SL-205T接种至血清瓶中,28℃培养.

好氧反硝化:将100mL的反硝化培养基注入到250mL血清瓶中通入高纯氦气,置换出血清瓶中的空气,再通入50mL的氧气,模拟空气中氧气含量,使血清瓶中处于有氧状态[19].然后密封、灭菌.最后接种2%(V:V)的菌株SL-205T至血清瓶中,28℃,150r/min下恒温培养.

以未接种的反硝化培养基作为空白对照,所有实验设置3个平行.每隔4h取样测定样品中溶解性有机碳(DOC)、硝态氮(NO3--N)、亚硝态氮(NO2--N)和好氧反硝化时的气态产物氧化亚氮(N2O),氮气(N2)的浓度,以及细菌生长状况(用OD600表示).

1.4 分析方法

细菌的生长采用光电比浊法在波长 600nm下进行测定.硝酸盐氮采用紫外分光光度比色法,亚硝酸盐氮浓度采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定,所用波长分别为220nm和540nm[20].样品中DOC的测定使用总有机碳 vario TOC型(德国elementar公司)分析仪进行测定.好氧反硝化研究中,含氮气体测定采用7890N型气相色谱仪(美国安捷伦公司),其中N2O的测定使用GC/ECD检测器,N2的检测使用GC/TCD检测器;pH值的测定使用雷磁PHSJ-3F型pH计(上海精科).

2 结果与讨论

2.1 菌株SL-205T的缺氧反硝化特性

图1 PHBV投加量对菌株SL-205T生长和硝酸盐去除的影响Fig.1 Effects of PHBV addition dosage on the growth and nitrate removal by strain SL-205T

2.1.1 PHBV投加量对反硝化的影响 菌株SL-205T是本实验室分离鉴定的能降解 PHBV的反硝化细菌.在不同PHBV含量的培养基中,菌株SL-205T的生长曲线如图1A所示.当PHBV投加量为1.0g/L和1.5g/L时,OD600的最大值分别为 1.5和 1.9.此时,硝酸盐的去除率分别为69.7%和79.53%(图1B).亚硝酸盐积累量分别为0.35mg/L和0.14g/L(图2).PHBV投加量增加到2.0g/L,OD600的最大值升高至2.64,硝酸盐去除率显著升高到 99.4%,亚硝酸盐没有积累.这一结果说明,碳源投加量是菌体生长和硝酸盐还原的限制性因素.碳源不足时,不能为反应提供充足的电子流,以至于不能为反硝化提供充足的能量[21],使反应不能彻底进行,造成中间产物亚硝酸盐的积累.继续增加碳源投加量至 2.5g/L,菌体生长和硝酸盐去除率都没有显著变化.不同碳源投加量的DOC变化趋势如图3所示. PHBV能在解聚酶的作用下降解成可溶性的有机碳,引起 DOC浓度升高.随着反应持续进行,DOC又不断被菌体利用,因此DOC呈现先增加后降低的趋势.

图2 PHBV投加量对亚硝酸盐生成的影响Fig.2 Effects of PHBV addition dosage on nitrite accumulation

图3 PHBV投加量对溶解性有机碳的影响Fig.3 Effects of PHBV addition dosage on DOC accumulation

以上研究结果表明,当初始硝酸盐氮浓度为315mg/L时,菌株 SL-205T进行反硝化的最适PHBV最佳投加量为2.0g/L.

图4 不同碳源对菌株SL-205T生长(a)、硝酸盐去除(b)、亚硝酸盐积累(c)和溶解性有机碳(d)变化的影响Fig.4 Effects of different carbon sources on the growth, nitrate removal, nitrite accumulation and DOC change by strain SL-205T

2.1.2 不同碳源对反硝化的影响 碳源在反硝化过程中提供菌体生长所需要的能量,并作为硝酸盐还原的电子供体.不同碳源会产生不同的氧化还原电位,进而导致脱氮效率不同[22].本研究选用3种可溶性碳源乙酸钠、琥珀酸钠、柠檬酸钠和固体碳源 PHBV,研究碳源对菌株 SL-205T脱氮性能的影响,结果如图5所示.以柠檬酸钠作为唯一碳源时,培养液最大 OD值为 0.6(图 4a),表明菌体几乎没有生长,硝态氮和 DOC浓度在反应过程中没有明显变化(图4b和图4d),表明菌株 SL-205T不能利用柠檬酸钠为碳源完成反硝化过程.当以乙酸钠、琥珀酸钠和PHBV为碳源时,硝酸盐的去除效率均达到99%以上;反应20h时硝酸盐的平均去除速率分别为16.14mg/(L·h)、13.44mg/(L·h)和 13.25mg/(L·h)(图 4b).由于乙酸钠分子结构简单,容易被细胞直接吸收利用[23],所以其脱氮效果最好.有研究表明,当以PHBV做为碳源时,Diaphorobacter能分泌胞外解聚酶,使PHBV降解成乙酸和三羟基丁酸[24-25]才能被继续利用.因此,在反应的起始阶段,以 PHBV为碳源的硝酸盐去除速率要低于乙酸钠和琥珀酸钠(图4b).由于PHBV逐渐被分解和利用,DOC呈现先增加后降低的趋势(图4d).

以上研究结果表明,菌株 D. polyhydroxybutyrativorans SL-205T不仅可以利用可溶性碳源乙酸钠和琥珀酸钠,同样可以利用固体碳源PHBV进行反硝化脱氮,为该菌株生物脱氮过程中碳源的选择提供了更大空间.

2.2 菌株SL-205T利用PHBV为碳源的好氧反硝化特性

目前,已发现了多种细菌具有好氧反硝化功能,但关于好氧反硝化研究应用的大多是可溶性碳源,对于固体碳源的好氧反硝化还少有研究报道.为此,我们研究了菌株SL-205T利用固体碳源PHBV的好氧反硝化性能,结果如图5所示.在反应的初始8h,硝酸盐浓度变化并不显著.随着反应的进行,硝酸盐浓度迅速降低.在反应的32h,硝酸盐去除率达到88.83%.此时菌株SL-205T生长旺盛,反硝化进程与细菌生长状态密切相关[26].在反应过程中,由于PHBV的降解产物为乙酸和三羟基丁酸[27],导致培养基pH略有降低,随着反硝化反应的进行,培养基内会有OH-积累,pH在10h后逐渐升高.当反应进行到 36h时,硝酸盐去除率达到 94.54%.菌株SL-205T在 36h内去除硝酸盐的平均速率达到8.69mg/(L·h),高于大多数已发现好氧反硝化菌利用可溶性碳源的硝酸盐去除速率(表1).比较表1中菌株SL-205T利用PHBV和可溶性乙酸钠作为碳源的数据可知,菌株SL-205T利用PHBV的反硝化速率略低于该菌株利用乙酸钠的反硝化速率,这是由于该菌株要先将PHBV降解成可溶性有机碳,才能使其有充足的碳源进行反硝化过程,同时引起DOC浓度呈现先增加后降低的趋势(图5).

图5 菌株SL-205T利用PHBV作为碳源的好氧反硝化特性Fig.5 Aerobic denitrification performance of strain SL-205Tusing PHBV as carbon source

表1 不同好氧反硝化菌的反硝化性能比较Table 1 A comparison for aerobic denitrification performance among different aerobic denitrifiers

亚硝酸盐是一项重要的水质理化指标,国际癌症研究协会(International Agency for Research on Canncer, IARC)报告认为,摄入亚硝酸盐可能会导致癌症[35].在水产养殖中,亚硝酸盐浓度超标会造成水生动物厌食、反应迟缓,甚至因缺氧而导致死亡等[8].在菌株 SL-205T的反硝化过程中,硝酸盐被菌体中的硝酸盐还原酶还原成亚硝酸,致使亚硝酸盐在反应的前16h有所积累,最高浓度为7.35mg/L.而亚硝酸盐的存在又会诱导亚硝酸还原酶的产生,从而使亚硝酸盐浓度降低[36].在反应的 36h后,未检测出亚硝酸盐,这与 Sun等[37]报道的Pseudomonas stutzeri T13脱氮效果一致.

反硝化过程的重要气态中间产物N2O 是一种重要的温室气体,对臭氧层有很强的破坏能力,在大气中不易扩散,而且增温能力强,是 CO2的150～300倍[38].因此,对于反硝化气态产物的检测很有意义.菌株 SL-205T发生好氧反硝化时气态产物的生成状况如图 5所示.在好氧反硝化过程中,N2O在20h有少量积累(0.6mg/L),在随后的反应中并未检测到N2O的存在.同时, N2在反应过程中不断积累,其浓度在32h达到237.88mg/L,随后保持稳定.这一结果表明,N2是菌株SL-205T好氧反硝化的最终气态产物,75.38%的初始硝态氮以 N2的形式被去除.根据以上结果分析,该菌去除硝态氮的途径是硝态氮首先转化为亚硝酸盐,随后生成 N2O,最后被还原为 N2.该菌株利用硝态氮进行好氧反硝化的氮平衡特征如表 2所示.根据氮平衡可推测出, 19%的初始硝态氮转化成菌体生物量,用于菌体自身代谢合成.由此看出,本文研究的Diaphorobacter属菌株SL-205T在反硝化方面不仅具有较高的脱氮速率,而且在好氧状态下反硝化作用完全,不积累中间产物亚硝酸盐和 N2O,表明该菌株在污水脱氮处理方面具有较好的应用前景.

表2 菌株SL-205T好氧反硝化去除硝酸盐的氮平衡(mg/L)Table 2 Nitrogen balance of nitrate removal during aerobic denitrification by strain SL-205T(mg/L)

3 结论

3.1 菌株D. polyhydroxybutyrativorans SL-205T可以利用可溶性碳源乙酸钠、琥珀酸钠以及固体碳源PHBV进行反硝化脱氮.以PHBV为唯一碳源进行缺氧反硝化反应,初始硝酸盐浓度为315mg/L时, PHBV的最适投加量为2.0mg/L.

3.2 菌株D. polyhydroxybutyrativorans SL-205T以PHBV为唯一碳源进行好氧反硝化时,硝酸盐的去除率高达 94.54%,平均去除速率达到8.69mg/(L·h),反应结束时没有中间产物亚硝酸盐和N2O的积累.

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中国环境科学学会2017年环境科学与技术年会通知

中国环境科学学会2017年科学与技术年会(简称2017学术年会)定于10月20～22日在福建省厦门市举办.会议主题是:创新驱动助推绿色发展.年会的主要内容包括:1)特邀主旨报告会(开幕式);2)第一届环保科技创新发展高端论坛;3)分会场研讨会和论坛;4)特邀主旨报告会(闭幕式);5)中国环境科学学会第八届理事会第四次常务理事会(扩大)会议;6)第一届国家环境保护工程技术中心技术交流年会;7)环境科技创新成果转化、发布和展示;8)全国环境科学学会秘书长工作交流会;9)颁发“环境保护科学技术奖”、“环保科学与技术创新应用示范项目”、“中国环境科学学会学术年会(2017)光大环保优秀论文奖”、“《中国环境科学》优秀论文奖”等.会议设开幕式和闭幕式主会场、二十六个分会场、六个论坛、二个国际研讨会以及七个专题活动.届时,来自全国环境学科的专家学者,政府环境部门管理者,企业单位的研究开发、工程技术人员等将出席会议.欢迎大家踊跃报名参加.

详情请见http://www.chinacses.org/newsNotice/2137.jhtml(关于举办中国环境科学学会2017年科学与技术年会的第二轮通知)

Denitrification performance of the bacterium Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans SL-205.

ZHANG Shu-song1,2, FAN Yue-ting1,2, SUN Xing-bin1, QIU Tian-lei2, GAO Min2, WANG Xu-ming2,3*(1.College of Life Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China；2.Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijng Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China；3.Key Laboratory of Urban Agriculture (North), Ministry of Agriculture, Beijing 100097, China). China Environmental Science, 2017,37(9)：3532～3539

In order to enhance nitrogen removal from nitrate-contaminated water, a novel bacterial strain, Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans SL-205T, was investigated to use different carbon sources for anoxic denitrification. Additionally, the aerobic denitrification performance for strain SL-205Twas studied using poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV) as the sole carbon source. The results showed that the removal efficiencies of nitrate reached up to over 99% by strain SL-205Tusing sodium acetate, sodium succinate and PHBV as carbon sources under the anoxic conditions. The optimum addition dosage of PHBV was 2.0g/L with 315mg/L of the initial nitrate nitrogen. Strain SL-205Thad the capability to fully remove as much as 97.4% of nitrate nitrogen, and the average removal rate for nitrate nitrogen was 8.69mg/(L·h) after 36h under the aerobic conditions. Meanwhile, both nitrite and nitrous oxide were not accumulated. The results above-mentioned would lay an experimental foundation for nitrogen removal from wastewater by strain SL-205T.

Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans SL-205T；nitrate:carbon source；poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV)；aerobic denitrification

X172

A

1000-6923(2017)09-3532-08

2017-01-18

国家自然科学基金(21077014);北京市自然科学基金(8152016);北京市农林科学院科技创新能力建设专项(KJCX20140420)

* 责任作者, 研究员, wangxuming@baafs.net.cn

张树松(1989-),女,黑龙江佳木斯人,东北林业大学博士研究生,研究方向为环境生物技术与水污染控制.发表论文3篇.