1株抗肿瘤银杏内生真菌的发酵条件及活性产物稳定性研究

许洁+周惠茹+马君千+董昆明+缪莉

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.13.060

摘要：对前期研究发现的1株分离自银杏树皮组织的具有良好的抗肿瘤活性内生真菌米曲霉菌（Aspergillus oryzae）YX-5菌株的发酵条件及活性产物稳定性进行研究。以发酵后的菌体干质量、粗提物质量和粗提物抗肿瘤活性为指标，对YX-5菌株的发酵温度、pH值、转速和发酵时间等条件进行优化。结果表明，最适宜的发酵条件为温度25 ℃、pH值7.0、摇床转速110 r/min、发酵时间7 d。以粗提物的抗肿瘤活性为指标，比较发酵液粗提物经热处理、酸碱处理、紫外照射和蛋白酶处理后的稳定性，发现YX-5菌株的活性产物在常温、中性和酸性环境中稳定性较好，对紫外线和蛋白酶有较强的抗性，但在超过100 ℃高温条件下或pH值超过9.0的碱性环境中稳定性较差。该菌株粗提物在自然条件下总体稳定性较高，不易发生变化，有利于活性成分分离工作的开展。

关键词：银杏；内生真菌；抗肿瘤活性；条件优化；稳定性测定

中图分类号： Q939.9文献标志码： A[HK]

文章编号：1002-1302（2017）13-0226-03[HS）][HT9.SS]

收稿日期：2016-03-17

基金项目：江苏省研究生科研创新计划（编号：CXLX12_0918）；扬州大学科技创新培育基金（编号：2015CXJ039）；中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室开放基金[编号：KLMD（OUC）201203]。

作者简介：许洁（1993—），女，江苏宿迁人，硕士研究生，主要从事海洋微生物的多样性及其天然产物、酶资源的开发与利用等研究。E-mail：xj930411@qq.com。

通信作者：缪莉，博士，副教授，主要从事海洋微生物资源及生物活性物质等研究。E-mail：miaoli@yzu.edu.cn。

[ZK）]

银杏树是距今约2亿年的幸存古老植物，其药用价值早在公元前2800年《神农本草》上就有记载。银杏中包含的萜类、黄酮类、聚异戊烯醇类等170余种化学成分，具有改善脑血管末梢和脑循环、抗菌消炎、抗病毒、抗癌、解痉抗过敏等重要的药理作用，以及延缓衰老、美容健发等保健作用[1]。近年来的研究发现，银杏提取物具有良好的抗肿瘤活性，冯小龙等的研究结果均表明，银杏提取物对多种肿瘤细胞具有较好的抑制作用，还能提高肿瘤组织对化疗的敏感性，进行天然免疫调节，对癌症治疗起辅助作用[2-7]。然而，银杏内酯含量低、分离纯化困难及银杏叶中银杏酚酸类有毒物质不易控制等问题限制了其在工业生产中的应用[8]。许多研究表明，植物内生真菌对某些次生代谢物的合成与转化具有与寄主共同的机制和途径。目前已有学者利用这一特性进行银杏内生真菌的研究，分别从其代谢产物中分离出黄酮类及内酯类抗肿瘤活性物质[9]，以更好地适应工业生产。内生真菌发酵过程中，不同的培养基初始pH值、培养时间、培养温度、摇床转速等都是十分重要的影响因素[10]，真菌产出代谢产物的产量随发酵条件变化有明显的差异，为了节省能源、降低成本，发酵条件的优化就显得十分必要。本研究中所用的内生真菌 YX-5菌株分离自银杏树皮组织，前期的研究结果显示其代谢产物具有显著的抗肿瘤活性[11]，采用ITS序列分析将其鉴定为米曲霉[12]。本研究对该菌株的发酵温度、pH值、转速和发酵时间等条件进行优化，并对该菌株代谢产物在热处理、酸碱处理、紫外照射以及蛋白酶处理下的稳定性进行研究，为进一步的大规模发酵和活性物质的分离提取提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

米曲霉菌（Aspergillus oryzae）YX-5菌株，為笔者实验室保存，是分离自银杏树皮组织的内生真菌。采用的指示肿瘤细胞为人宫颈癌HeLa细胞，购自上海复祥生物科技有限公司。

细胞培养基（1 L）：1袋RPMI-1640细胞培养基，加入10%灭活的新生牛血清和1%二抗母液，用0.24% NaHCO3、0.2%羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液（HEPES）调节pH值至 7.1～7.3，经0.22 μm孔径滤膜过滤，滤液于4 ℃保存。

GPY培养基（1 L）：20.0 g葡萄糖；5.0 g蛋白胨；5.0 g酵母浸膏。

1.2试验方法

1.2.1发酵条件优化

发酵条件优化试验共设置4个因素：发酵温度、pH值、摇床转速、发酵时间。温度分别设置为20、25、30、35 ℃；pH值分别设置为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0；转速分别设置为0、80、110、140、170 r/min；时间分别设置为3、5、7、9、13 d。将活化所得菌株挖块接种于 50 mL GPY培养基中，在各条件下发酵培养后，用8层纱布过滤，收集菌丝烘干称质量，滤液经乙酸乙酯萃取旋转蒸发后称取粗提物质量，采用SRB法[13]测定粗提物的抗肿瘤细胞活性，测试浓度为12.5 μg/mL。按照生长情况和粗提物抗肿瘤细胞活性情况确定最佳发酵条件。

1.2.2活性物质稳定性研究

将活化所得的YX-5菌株挖块接种于50 mL GPY培养基中，于25 ℃振荡培养5 d后过滤掉菌体，滤液按热稳定性、酸碱稳定性、UV稳定性、蛋白酶稳定性作不同的处理，采用SRB法[13]测定粗提物的抗肿瘤细胞活性，测试浓度为12.5 μg/mL。以抗肿瘤活性为指标，研究其活性物质的稳定性。

热稳定性：将滤液分别置于40、60、80、100、120 ℃下处理2 h后取出冷却，以未经加热处理的发酵液为对照。

酸碱稳定性：分别用1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH处理发酵液，使其pH值分别为酸性的3.0、4.0和碱性的10.0、11.0，静置12 h，以未经处理的发酵液为对照。endprint

UV稳定性：将滤液置于254 nm紫外分析仪下分别照射30、60、90、120、150 min，以未经紫外照射处理的发酵液为对照。

抗蛋白酶稳定性：在一份滤液中加入5 mg蛋白酶K于水浴锅中58 ℃孵育2 h，pH值调为8.0，另一份加入5 mg胰蛋白酶于水浴锅中37 ℃孵育2 h，pH值调为8.0，以未经蛋白酶处理的发酵液为对照。

2结果与分析

2.1发酵条件优化

2.1.1发酵温度

由表1可知，YX-5菌株在30 ℃时菌体生长情况最佳，其次为25 ℃，但2种情况下差别不明显。同时，在25 ℃时粗提物质量和抗肿瘤活性均达到最大值。温度过低（20 ℃）和过高（35 ℃）时，都对菌体的生长、代谢产物的产生以及代谢产物的抗肿瘤活性有抑制作用。因此，25 ℃为最适宜的发酵温度。

2.1.2培养基pH值

由表2可知，YX-5菌株在pH值为5.0时菌体质量最大，达0.298 g，pH值为6.0时次之，随着pH值降低或升高，菌体质量都有所减小，在pH值为11.0时菌体质量最小，为0.215 g。而粗提物质量随着pH值升高呈先增加后降低的趋势，pH值为7.0时粗提物质量为8.4 mg，pH值为8.0时粗提物质量达最大值，为8.6 mg，之后粗提物质量明显下降，当pH值为11.0时粗提物质量只有3.0 mg。粗提物的抗肿瘤活性在pH值为3.0、7.0时最高，抗肿瘤细胞抑制率均为99.22%，酸性和中性条件对YX-5活性物质的产生都较为适宜，此时所测得的抗肿瘤细胞抑制率均高于90%，但是当pH值在9.0及以上时，其抗肿瘤细胞抑制率明显下降。综合菌株生长、粗提物质量与抗肿瘤活性来看，YX-5菌株发酵的最佳pH值为7.0。

2.1.3摇床转速

发酵时通气量的控制可根据摇床转速来调节，转速越高，通气量越大。由表3可知，YX-5菌株在所测试的各转速下都能较好地生长和产代谢产物，其抗肿瘤活性也差别不大， 对抗肿瘤细胞的抑制率均大于90%， 表明溶解氧的含量对该菌株的生长和代谢影响较小。综合菌体生长情况和粗提物产量来看，摇床转速为110 r/min时相对较好。

2.1.4发酵时间

由表4可知，YX-5菌株的菌体质量和粗提物质量都随着发酵时间的延长而增加，发酵前期的7 d内增长速度较快，菌体质量达到0.358 g，粗提物质量为 6.7 mg，7 d之后增长速度变慢，到后期几乎保持不变。粗提物抗肿瘤细胞的抑制率随发酵时间的延长呈先增加后降低的趋势，发酵7 d时抗肿瘤细胞抑制率最高，达93.36%，发酵 7 d 后抑制率开始下降，发酵13 d时，抗肿瘤细胞抑制率下降到82.45%。综合来看，YX-5菌株以发酵7 d最为适宜。

2.2活性物质稳定性研究

2.2.1热稳定性测定

以粗提物对肿瘤细胞的抑制率为试验指标，测定活性产物的热稳定性。对照组（20 ℃）的发酵液粗提物对肿瘤细胞的抑制率达97.27%，经40、60、80 ℃处理的发酵液粗提物对肿瘤细胞的抑制率没有明显变化，当温度为100、120 ℃时，抑制率明显下降（图1）。表明YX-5菌株的活性产物在100 ℃内比较稳定，但在100 ℃以上的高温环境下稳定性降低。

2.2.2酸碱稳定性测定

pH值优化试验结果显示，YX-5菌株在酸性和中性环境中发酵，其粗提物的抗肿瘤活性均能达到90%以上， 而在 pH 值高于 9.0时， 抗肿瘤活性明显下

降，粗提物的质量也相应下降（表2）。为了明确粗提物抗肿瘤活性下降的原因是活性物质的产量变少还是结构不稳定，对自然pH值条件下发酵后的发酵液进行酸碱处理，调节发酵液的pH值为3.0、4.0、10.0、11.0，而未经处理的对照组发酵液pH值为6.5，分别对各组发酵液的粗提物进行抗肿瘤活性测试。由图2可知，酸处理后粗提物对肿瘤细胞的抑制率和未处理的相比并无明显区别，而碱处理后抑制率明显下降，pH值为11.0时抑制率降为60.99%。表明YX-5菌株的活性产物在中性和酸性环境下稳定性较好，而在碱性环境下则稳定性下降。

2.2.3UV稳定性测定

由图3可知，YX-5菌株的活性产物有较强的抗紫外线照射能力，不同紫外线照射时间处理的粗提物对肿瘤细胞的抑制率都维持在97%～99%之间，变化范围较小，且与未经紫外照射的对照组相比几乎没有差异。

2.2.4抗蛋白酶穩定性测定

YX-5菌株的发酵液分别经100 μg/mL蛋白酶K、100 μg/mL胰蛋白酶处理，测试其粗提物的抗肿瘤活性。由图4可知，经胰蛋白酶处理的粗提物对肿瘤细胞的抑制率下降到85.69%，降幅为11.58%，而经蛋白酶K处理的仅下降了5.14%。表明真菌YX-5菌株的活性物质抗蛋白酶活性较好。

3讨论与结论

对于不同的菌株来说，其发酵条件不尽相同，选择合适的发酵条件，可以在后期的大规模发酵中降低成本，减少工作量。银杏内生真菌球毛壳菌SG0016菌株液体发酵的最佳培养条件为培养温度23 ℃、培养时间7 d、装液量 100 mL/250 mL、接种量10%[14]，而另一株银杏内生真菌G10适宜的发酵温度为24.5 ℃，pH值为7.5，转速为 180 r/min[15]。本研究结果显示，YX-5菌株的生长和活性物质的产生对培养温度、转速、pH值的要求不高，一般的发酵条件均能满足其生长和代谢。

内生真菌代谢产物的稳定性随菌株不同而各有差异，在郝双红等的研究中发现，一般内生真菌活性产物均不耐酸碱与高温[16-17]。而对YX-5菌株的提取物进行稳定性测试，结果表明，无论是高温、酸处理、紫外线照射还是蛋白酶处理，对其抗肿瘤活性的影响都不大，仅在碱性条件（pH值>9.0）下其活性会发生较大幅度的下降，因此，只需尽量避免强碱就可保持其活性产物的稳定性。该菌株粗提物总体稳定性较高，在自然条件下不易发生变化，这对后期的活性成分分离工作十分有利。endprint

本研究中以银杏内生真菌YX-5菌株的生长情况及其活性物质的产量和抗肿瘤活性为指标，对其发酵条件及提取物的稳定性进行了研究，确定了YX-5菌株的最佳发酵条件为发酵温度25 ℃、pH值7.0、摇床转速110 r/min、发酵时间7 d，此时提取物的抗肿瘤活性具有较高的稳定性。

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