番茄早疫病拮抗放线菌10—4菌株的发酵条件

何建清　张格杰　尹明远

摘要：放线菌10-4菌株对番茄早疫病具有良好的拮抗效果，为进一步提高放线菌10-4菌株发酵液生产抑菌活性物质的产量，通过单因素和正交试验研究发酵培养液、培养温度、种龄、初始pH值、接种量等条件对10-4菌株抑制番茄早疫病病原菌效果的影响。结果表明，最佳发酵培养液配比为2.000 g可溶性淀粉、0.001 g FeSO4、0.050 g NaCl、0.050 g K2HPO4、0.050 g MgSO4、0.100 g KNO3、100 mL蒸馏水。10-4菌株发酵的优化条件：温度为28～34 ℃，种龄为 32 h，初始pH值为8，接种量为5%。正交试验结果表明，发酵条件的最优组合为A1B1C1，即发酵温度为28 ℃，发酵时间为 72 h，装液量为60 mL（装液瓶为250 mL），此时10-4菌株生产抑菌活性物质的效果最好，生防放线菌10-4菌株的发酵培养液可有效抑制番茄早疫病病原菌，抑制率高达96.2%。

关键词：番茄早疫病；拮抗效果；放线菌10-4；发酵条件；优化；抑菌活性；产量

中图分类号： S436.412.1+4文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）14-0079-03

早疫病是番茄生产上重要的病害之一，由茄链格孢属真菌（Alternaria solani）引起，该菌寄主范围广泛，除番茄外，还可感染辣椒、茄子、曼陀罗和马铃薯等[1]。该病常年造成番茄减产20%～30%，严重时可达 50%以上，甚至绝产[2]。目前生产上并无高抗或免疫的品种，因此运用抗病种质防治该病并不现实[3]，而化学农药的长期过量使用，又会导致病原菌抗性增强，对环境污染加重，以及番茄果实有农药残留等现象，因而，探寻新的防治番茄早疫病的方法和药剂是目前生产上亟待解决的问题。利用微生物来防治植物真菌病害是当今植物真菌病害界十分热门的研究领域之一。微生物防治是指通过生物间的相互作用，利用有益微生物或其代谢产物抑制致病微生物生长的生物防治手段[4]。微生物资源丰富、选择性强、无残留、无污染、成本低、兼防兼治、增产增收、保持生态平衡、起到长效的作用，所以具有广阔的发展前景[5]。放线菌是最早被研究且应用到生产中的能产生大量抗生素的一种生防微生物，已有利用放线菌防治番茄早疫病害的报道[6]。菌株10-4是笔者所在课题组从西藏色季拉山亚高山草甸土壤中分离筛选出的1株对番茄早疫病菌有较强抑制作用的菌株，初步鉴定为腐生链霉菌[7]。为提高其产素水平，为工业发酵生产提供依据，本研究采用生长速率法对不同培养基和发酵条件下10-4 菌株发酵液的抑菌活性进行测定，旨在筛选适宜的培养基和优化其适宜的发酵条件，以期为农用活性物质的开发和分离提供依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验菌菌株10-4，分离自西藏色季拉山亚高山草甸土壤中。

1.1.2指示菌番茄早疫病菌，由西藏大学农牧学院真菌实验室提供。

1.1.3培养基配方种子培养液：3 g蛋白胨，2.5 g葡萄糖，2 g CaCO3，1 000 mL 1%大豆饼粉浸汁，pH值为7.2。发酵培养液：选用12种发酵培养基（表1）[8-9]，各培养基 pH 值均为7.2，所有培养基均在 121 ℃、0.1 MPa 条件下灭菌 30 min 后备用。

1.2试验方法

1.2.1初始发酵培养液基筛选将菌株10-4活化，用打孔器打成直径为5 mm的菌块，在250 mL三角瓶中接入50 mL种子培养液，再将菌块放入三角瓶中，于 28 ℃、160 r/min 培养 4 d，获得种子液。在250 mL 三角瓶中分别装入50 mL 12种发酵培养基，按1% 的体积分数接入种子液，28 ℃、160 r/min 振荡培养4 d后，培养滤液10 000 r/min 离心 25 min，上清液用直径为 0.45 μm 的无菌过滤膜过滤，将滤液与 PDA 培养基按体积比1 ∶[KG-*3]9制成平板，接入直径为 5 mm 预先活化的指示菌块，以不加发酵液的PDA 为对照培养基，设3次重复。28 ℃下培养4 d，测量菌落直径，计算抑菌率，评价代谢物的活性。根据菌丝生长抑制率确定最佳发酵培养液。菌丝生长抑制率= （对照菌落直径-处理菌落直径） /对照菌落直径×100%。

1.2.2培养温度对发酵液抑菌活性的影响在250 mL三角瓶中先接入50 mL“1.2.1”节中筛选出的发酵培养液，再接入1 %种子液，设24、26、28、30、32、34 ℃等6个温度水平，160 r/min 振荡培养4 d。按“1.2.1”节中的方法确定最佳的培养温度。

1.2.3种子液种龄对发酵液抑菌活性的影响将“1.2.1”节中筛选出的培养基以1%的量分别接入种龄为24、28、32、36、40、44、48、52、56、60 h的种子液，28 ℃、160 r/min振荡培养3 d，按“1.2.1”节中的方法确定最佳的接种菌龄。

1.2.4初始pH值对发酵液抑菌活性的影响将“1.2.1”节中筛选出的培养基用HCl、NaOH分别调节pH值为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，高压灭菌，接入1 %种子液，在28 ℃、160 r/min 条件下培养3 d，用生长速率法测定发酵液的抑菌作用。

1.2.5接种量对发酵液抑菌活性的影响将50 mL发酵液装于250 mL的三角瓶中，将培养36 h的种子液以1%、3%、5%、7%、10%、15%、20%的量（体积分数）分别接入发酵瓶中，培养3 d并进行效价的生物测定。

1.2.6发酵條件的正交试验在以上试验结果的基础上，选取发酵温度、装液量、发酵时间为主要发酵条件，设计3因素3水平的正交试验，结果如表2所示。按不同的发酵条件发酵培养后，测定发酵液抑菌率的大小。

2结果与分析

2.1发酵培养基的筛选

由图1可知，10-4菌株在1号培养基中发酵的滤液不能抑制番茄早疫病病原菌的生长；在其余11种发酵培养基中发酵，菌株10-4均能产生抑制番茄早疫病病原菌的抗生素，其中9号培养基的抑菌率较高，达90.2%，因此，选择9号培养基进行后续试验。

2.2培养温度对10-4菌株发酵液抑菌活性的影响

在发酵过程中，菌体生长和产物的形成是在众多酶的催化下进行的，适宜的温度是保证酶活性的基本条件，也是使产物高产的保证。由图2可知，温度对10-4菌株发酵液抑菌活性的影响较大，28～34 ℃有利于10-4菌株产生抑菌物质。

2.3种子液种龄对10-4菌株发酵液抑菌活性的影响

将种子液按不同种龄以1%的量接入摇瓶发酵培养基中，于28 ℃、160 r/min下振荡培养3 d，测定其抑菌率。由图3可知，种子液种龄的最佳时间为32 h，此时菌体处于生命力旺盛的对数生长期。种龄太短，菌体量太少，会使发酵周期延长；种龄太长，菌体衰老，产素率降低，菌体较早自溶，影响抗生素的提取。

2.4初始pH值对10-4菌株发酵液抑菌活性的影响

将9号培养基分别调节pH值为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，高压灭菌，按1%的量接10-4菌株的种子液于发酵瓶，在 28 ℃、160 r/min条件下培养3 d，用生长速率法测定抑菌作用。由图4可知，发酵液的初始pH值对10-4菌株发酵液的抑菌活性影响较大，pH值为8时，抑菌活性达到最高点，pH值低于6或高于9都不利于10-4菌株生产抗生素。说明弱碱性有利于产物活性的提高。

2.5接种量对10-4菌株发酵液抑菌活性的影响

由图5可知，最适的种子液接种量为5%，此时10-4菌株发酵液的抑菌活性最高。

2.6发酵条件的正交试验

在以上试验结果的基础上，选取发酵温度、装液量、发酵时间为主要发酵条件，设计3因素3水平的正交试验，按不同的發酵条件发酵培养后测定抑菌率。 由表3可知，发酵条件的最优组合为A1B1C1，即发酵温度为28 ℃，发酵时间为 72 h，装液量为60 mL，此时10-4菌株生产抑菌活性物质的效率最高，生防放线菌10-4菌株的发酵培养液可有效抑制番茄早疫病病原菌，抑制率高达96.2%。对正交试验的结果进行极差分析可知，各因素对10-4菌株生产抑菌活性物质的影响表现为发酵温度>装液量>发酵时间。

3结论

从不同培养基对10-4菌株发酵液的生物活性来看，10-4菌株的最佳初始发酵培养基为9号培养基，即2.000 g可溶性淀粉、0.001 g FeSO4 、0.050 g NaCl、0.050 g K2HPO4、0050 g MgSO4、0.100 g KNO3、蒸馏水100 mL。10-4菌株发酵液发酵过程的优化条件：温度为28～34 ℃，种龄为32 h，初始pH值为8，接种量为5%。正交试验结果表明，发酵条件的最优组合为A1B1C1，即发酵温度为28 ℃，发酵时间为 72 h，装液量为60 mL，此时10-4菌株生产抑菌活性物质的效率最高，生防放线菌10-4菌株的发酵培养液可有效抑制番茄早疫病病原菌，抑制率高达96.2%。由正交试验极差分析结果可知，各因素对 10-4菌株生产抑菌活性物质的影响表现为发酵温度>装液量>发酵时间。

发酵是抗生素产业化的基础，这是因为尽管生防菌产抗生素的性能优良，但若缺乏合理的发酵工艺，也不能将其潜力充分发挥。抗生素发酵除受营养因素的限制以外，合适的发酵条件也是不可忽视的重要因素。目前，就抗生素制备的农药数量、质量和品种而言，还远远不能满足农业生产发展的需求。因此，如何提高抗生素发酵的产量已成为近年来相关学者研究的热点[10]。为了提高放线菌10-4菌株的抑菌活性，本试验通过单因素试验和正交试验方法，对其摇床发酵培养基及发酵条件进行研究。结果表明，放线菌10-4菌株在初始pH值为8的9号培养液中，28 ℃下持续振荡培养32 h，其抑菌物质的活性最高。

此外，由于10-4菌株发酵液中活性物质的成分是未知的，本试验采用生物活性测定作为指示方法，但生物活性测定误差较大，所以后续的研究中应在明确活性物质的种类后，以活性物质的量为指标，筛选出更佳的培养液配方和发酵工艺条件，以便进一步开发利用10-4菌株。

参考文献：

[1]陈 羽，张顺琦，陈夕军，等. 番茄早疫病生防细菌B731的分离、鉴定及抑菌防病作用[J]. 中国生物防治学报，2015，31（3）：361-368.

[2]曲一凡，张琪，浦冠勤. 番茄早疫病菌生物学特性及综防技术[J]. 长江蔬菜，2010（23）：37-38.

[3]Abdussamee H，Hussain M，Ali M，et al. Genetic response of tomato germplasm against early blight and its management through fungicides[J]. Applied Science Reports，2014，2（3）：119-127.

[4]刘琴，刘翼，何月秋，等. 我国植物病害生物防治综述[J]. 安徽农学通报，2012，18（7）：67-69.

[5]胡青平. 番茄早疫病菌（Alternaria solani）广谱拮抗微生物的选育及拮抗机理研究[D].西安：西北大学，2008.

[6]董艳，陈永福，张和平.番茄早疫病害微生物防治研究进展[J]. 中国农学通报，2015，31（17）：111-115.

[7]何建清，张格杰，岳海梅，等. 番茄早疫病菌拮抗放线菌 10-4 的鉴定[J]. 植物保护学报，2010，37（4）：307-312.

[8]孟庆芳，张汀，杨文香，等. 拮抗链霉菌 S23 发酵条件的研究[J]. 中国生物防治学报，2002，18（2）：79-82.

[9]韩斯琴，徐梅，白震，等. 番茄灰霉病菌拮抗菌 D2-4 发酵条件的研究[J]. 东北农业大学学报，2004，35（1）：93-98.

[10]魏松红，付丹妮，逄若霖，等. 除草活性放线菌 DN5发酵条件及发酵产物理化性质的研究[J]. 中国生物防治学报，2011，27（2）：246-253.