藏猪源解淀粉芽孢杆菌的益生性、安全性和应用性研究

郭政宏+周彪+严亨秀

摘要：探讨1株来自藏猪粪便中具有一定体外益生潜力的解淀粉芽孢杆菌SWUN-TP23在动物体内的益生性、安全性及添加到饲料中的应用性。结果表明，按108 CFU/mL饲喂小鼠对其生长性能影响最大，可促进小鼠胸腺和脾脏发育，日均增质量较对照组提高1倍左右，在肉眼和光学显微镜下观察小鼠心、肝、脾、肺、肾等内脏均未发现明显的病理变化；将解淀粉芽孢杆菌SWUN-TP23添加到发酵饲料中，可降解一定量的黄曲霉毒素B1。试验表明，该菌株能提高小鼠生长性能，增强小鼠的免疫力，安全无毒，且添加到发酵饲料中还能在一定程度上降低饲料中黄曲霉毒素B1的含量，具有一定的应用价值。

关键词：藏猪；解淀粉芽孢杆菌；益生性；安全性；黄曲霉毒素B1

中图分类号： S852.6文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）14-0137-03

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一种在形态、生理生化、培养特征等方面与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）非常相似的芽孢杆菌，在生长繁殖过程中能产生许多淀粉酶、蛋白酶、抑菌物等代謝产物[1]。2007年，解淀粉芽孢杆菌FZB42全基因组序列的测定，使人类对这种芽孢杆菌有了更多的了解，同时也了解了淀粉芽孢杆菌在多方面的研究应用[2]；如在动物饲养研究中，González-Ortiz等用解淀粉芽孢杆菌CECT5940、屎肠球菌CECT4515复合制剂饲喂成年狗，促进了营养物质的消化吸收、降低了粪便中致病菌的含量[3]；在环境保护研究中，高大响等从健康鸡粪便中分离到1株具有除臭作用的解淀粉芽孢杆菌[4]。李超等从滇池富营养化水中分离筛选得到1株对鱼腥藻生长具有抑制效果的解淀粉芽孢杆菌DC1[5]等。黄曲霉毒素（aflation，简称AFT）是由黄曲霉等真菌产生的次级代谢产物，具有抑制免疫、致癌的作用，威胁着畜牧业及饲料工业，其中影响最大、分布最广的就是黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，简称AFB1），目前，利用微生物对AFB1进行生物降解，具有特异性强、效率高等优点[6]。

动物体外肠道模型与动物机体胃肠道环境有一定的差异，一株潜在的益生菌能否在动物体内产生益生作用，终须进行动物试验等应用性研究。此次试验主要探讨解淀粉芽孢杆菌SWUN-TP23对动物生长性能的影响、对动物的安全性及添加到饲料中对黄曲霉毒素B1的降解能力，以期为解淀粉芽孢杆菌SWUN-TP23应用于畜牧生产提供一定的参考依据。

1材料与方法

1.1试验菌株

西南民族大学生命科学与技术学院现代生物技术中心在前期试验中分离筛选到的具有一定体外益生潜力的解淀粉芽孢杆菌SWUN-TP23。

1.2主要试剂

胰酪胨大豆肉汤培养基（trypticase soy broth，简称TSB），购于青岛海博生物技术有限公司；黄曲霉毒素B1，购于美国SUPELCO公司；Mayer氏苏木素染液、伊红复染液，购于珠海贝索生物技术有限公司；黄曲霉毒素B1 ELISA试剂盒，购于南昌博恒生物制品有限公司。

1.3主要仪器

电子分析天平（梅特勒-托利仪器有限公司）、光学显微镜、病理图像分析系统（日本OLYMPUS公司）、微量移液器（德国EPPENDORF公司）、石蜡包埋机、普通石蜡切片机，（德国LEICA公司）、病理组织漂烘仪（常州中威电子仪器有限公司）、细胞超声破碎仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.4试验动物

Balb/c小鼠25只（SPF级），雌性，6～7周龄，体质量 20～25 g，购于四川大学实验动物中心，饲养于SPF级动物房。

1.5小鼠饲喂试验

1.5.1益生性试验

挑取菌株接种于胰酪胨大豆肉汤培养基（TSB）中，37 ℃培养12 h，调整细菌浓度为106、107、108 、109 CFU/mL。将25只小鼠随机分成5组，每组5只，设置空白对照组、106、107、108、109 CFU/mL组。每组每只小鼠分别灌服0.5 mL无菌TSB液体培养基，106、107、108、109 CFU/mL的菌株菌液。连续灌胃21 d，每天观察并记录小鼠活动量、增质量、有无腹泻等。正常饲喂21 d后，将各组小鼠处死，解剖取出脾脏和胸腺，称质量并记录，计算胸腺指数和脾脏指数[7]。胸腺指数=胸腺质量（mg）/体质量（g）；脾脏指数=脾脏质量（mg）/体质量（g）。

1.5.2安全性试验

解剖观察各组小鼠内脏器官是否有肉眼可见的病理变化，并取小鼠心、肝、脾、肺、肾制作病理石蜡切片显微观察是否有组织病变。

1.6对黄曲霉毒素B1（AFB1）降解试验

1.6.1确定菌株有无降解AFB1能力

取10 mL经过12 h培养的菌株菌液，4 ℃条件下5 000 r/min离心30 min，分离上清液和菌体沉淀，上清液用0.22 μm孔径滤器过滤并于4 ℃保存备用，菌体沉淀用无菌TSB液体培养基洗涤离心2次，加入10 mL无菌生理盐水制成菌体沉淀悬液备用；另取 10 mL 菌株发酵液，4 ℃条件下5 000 r/min离心30 min，弃上清液，将菌体沉淀用无菌TSB液体培养基洗涤离心2次，加入10 mL无菌TSB液体培养基制成菌悬液，再将菌悬液进行超声波破碎，4 ℃条件下10 000 r/min离心20 min，离心后的上清液用0.22 μm孔径滤器过滤制得胞内液，并于4 ℃条件下保存备用。将400 μL全菌液、菌株上清液、菌体沉淀悬液、胞内液及无菌TSB液体培养基中分别加入到100 μL黄曲霉毒素B1标准液中，于37 ℃恒温培养箱中避光反应48 h，用黄曲霉毒素B1 ELISA试剂盒对黄曲霉毒素B1的降解量进行测定并计算降解率[6]。黄曲霉毒素B1降解率=（1-试验组黄曲霉毒素B1含量/对照组黄曲霉毒素B1含量）×100%。

1.6.2降解AFB1应用试验

将1 kg饲料平均分成试验组和对照组，按料 ∶[KG-*3]水=2 ∶[KG-*3]1（即2 kg饲料中加1 kg水）的比例，在试验组饲料中加入250 mL菌株发酵混合液，在对照组饲料中加入250 mL无菌TSB液体培养基，并充分搅拌均匀，于37 ℃恒温培养箱中发酵15 d；在饲料发酵开始后第0、1、3、5、7、9、11、13、15天，分别采集样品10 g，用黄曲霉毒素B1 ELISA试剂盒检测发酵饲料中的黄曲霉毒素B1的含量，并计算降解率。

2结果与分析

2.1小鼠饲喂试验

2.1.1益生性试验

由表1可知，不同浓度的解淀粉芽孢杆菌SWUN-TP23对小鼠生长性能有不同的影响，其中按 108 CFU/mL 饲喂小鼠对其生长性能影响最大，可使日均增质量较对照组提高1倍左右；同时，与对照组比较，菌株对小鼠胸腺指数和脾脏指数均有一定促进作用，这说明解淀粉芽孢杆菌SWUN-TP23不但能提高小鼠生长性能，还能在一定程度上促进小鼠免疫器官发育。

2.1.2安全性检测

任何菌株在生长代谢过程中不但能产生水解酶类等，也可能会产生一些毒素，通过安全性试验可检测解淀粉芽孢杆菌SWUN-TP23是否会产生对宿主有害的毒素等。通过试验，在对照组和各试验组小鼠饲喂期间，各组小鼠精神状态无差异，无腹泻情况发生，无类似中毒症状出现，解剖后肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等内脏无病变，光学显微镜下观察病理切片无明显病理变化（图1）。

2.2对黄曲霉毒素B1降解试验

2.2.1菌株对AFB1的降解能力

由图2可知，解淀粉芽孢杆菌SWUN-TP23培养液不同组分对AFB1降解率各不相同，与对照相比，全菌液和上清液降解能力较强，分别为 42.13%、31.57%；菌体沉淀悬液降解能力较差，仅为 3.48%；胞内液基本没有降解能力。因此，可认为解淀粉芽孢杆菌SWUN-TP23能代谢产生对黄曲霉毒素B1具有一定降解作用的物质，且该物质主要存在于菌株培养液的上清液中。

2.2.2降解AFB1应用试验

由图3可知，在第13天时，对照组发酵饲料中黄曲霉毒素B1的含量为10.88 μg/kg，已超过国家安全限量（10 μg/kg）[8]，而试验组发酵饲料中黄曲霉毒素B1的含量为6.85 μg/kg，低于国家安全限量，说明在饲料中添加解淀粉芽孢杆菌SWUN-TP23能够在一定程度上降低饲料中AFB1含量，以提高饲料饲喂动物的安全性。

3讨论

动物体质量的增加与减少是动物机体对营养物质代谢能力和健康状况最直接的反映，益生性试验结果说明各个浓度的解淀粉芽孢杆菌SWUN-TP23都能提高小鼠的生长性能，其中按108 CFU/mL饲喂小鼠可使日均增质量较对照组提高2倍左右，究其原因可能是解淀粉芽孢杆菌SWUN-TP23定植于小鼠肠道中，促进了肠道对蛋白质等营养物质的分解吸收，从而提高了小鼠的生长性能。除此之外，安全性试验结果表明，该菌株不会代谢产生使动物机体中毒的物质，影响饲喂动物安全。

饲料霉变、霉菌毒素残留与污染是在畜牧业生产中很严重的问题。饲料或环境中各种霉菌孢子在适宜的环境下会萌发成各种霉菌，并迅速生长使饲料结块、发霉，产生霉菌毒素，污染饲料与环境[9-10]，其中危害最大的就是黄曲霉毒素B1。通过降解应用性试验研究，将解淀粉芽孢杆菌SWUN-TP23添加到发酵饲料中能在一定程度上降低饲料中黄曲霉毒素B1的含量，保证饲料对动物的安全性；在降解黄曲霉毒素应用性试验中，菌株对黄曲霉毒素降解率为37.04%，较降解能力试验中42.13%低，可能是由于菌株在不同生长环境中增殖速率等不同导致的。

4结论

通过对菌株益生性、安全性和降解黄曲霉毒素B1能力的研究，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SWUN-TP23对小鼠安全无毒，能提高小鼠生长性能，增强免疫力，且将解淀粉芽孢杆菌SWUN-TP23添加到发酵饲料中还能在一定程度上降低饲料中黄曲霉毒素B1的含量。

参考文献：

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