药物阻断孵化鸡胚禽衣原体垂直传播作用

朱雅宁石瑜袁雪涛苏欣

（1，天津市动物疫病预防控制中心 300402；2，天津市静海区动物疫病预防控制中心 301600）

药物阻断孵化鸡胚禽衣原体垂直传播作用

朱雅宁1石瑜1袁雪涛1苏欣2

（1，天津市动物疫病预防控制中心 300402；2，天津市静海区动物疫病预防控制中心 301600）

禽衣原体病 （Avian Chlamydiosis,AC）是一种能够通过接触在禽类个体中传播的疾病，甚至可以通过禽类动物传染给人类，它的发生和鹦鹉热衣原体直接相关。最初由衣原体导致的发生在人类和鸟身上的疾病被叫做鹦鹉热，而将非因鹦鹉类禽鸟导致的衣原体疾病叫做鸟疫，事实上这两种疾病在症状方面没有任何区别。在传播途径上，国内外普遍认为鹦鹉热衣原体的传播途径为接触传播、空气气溶胶传播和生殖道传播或人工授精途径。虽然怀疑有垂直传播，但一直缺乏足够证据，最近新发现，鹦鹉热衣原体传播3个途径:种蛋卵黄囊膜垂直传播、鸡弱毒疫苗传播和SPF鸡种蛋传播。这3种途径传播范围广，造成的危害更广。如果能有效阻断垂直传播途径，可以有效减少鹦鹉热衣原体的传播和发病，为禽衣原体的防治提供新的技术途径。

面对家禽衣原体病具有垂直传播的风险。因此，选择敏感性高的抗菌素对7～8日龄鸡胚进行注射，实施药物阻断，从而从传染源头上阻断传染源，阻断对商品代家禽的危害。本次选择天津市某种禽场为药物阻断试验基地，蛋种鸡品种为尼克红，存栏规模为50000套。前期调查发现种禽产蛋高峰期血清抗体阳性率达100%，卵黄膜衣原体检出率达到65%。衣原体感染已经严重危害种禽场的生存问题。

1 材料

1.1 种蛋来源

选择孵化至7～8日龄的种蛋 （种蛋由天津龙威禽业有限公司提供），首先进行1000枚的小批量阻断试验，在此基础上进行10000枚药物阻断试验，对照组未采用任何药物处理，处理后观察其出壳体重、出雏率和卵黄蒂衣原体残留。

1.2 药物

盐酸强力霉素和盐酸环丙沙星原料药:购自天津恒基利得科技发展有限公司，批次为20130502和20120820。

2 方法

2.1 药物的配制

2.1.1 盐酸强力霉素

称取2mg强力霉素，加入2ml灭菌蒸馏水，配成1mg/ml的原液 (即 1000μg/ml)。

2.1.2 盐酸环丙沙星

称取2.5mg，加入2.5ml蒸馏水，配成lmg/ml的原液 (即1000μg/ml)。以上药物均用0.22μm的针头滤器过滤除菌，置于-20℃冰箱保存。

2.2 吉姆萨染色方法

2.2.1 固定

无菌取卵黄膜，无菌生理盐水洗涤卵黄膜，在玻片上展开，后采用甲醇或丙酮固定10～15min。

2.2.2 染色

先用pH为6.8的PBS将吉姆萨母液做10倍稀释，取稀释后液体覆盖细胞标本，置于湿盒中，置于37℃温箱中孵育30min后用蒸馏水冲洗，自然晾干。

2.2.3 观察

在显微镜下观察结果，阳性结果表现为:Vero细胞胞质呈天蓝色，衣原体包涵体呈紫红色的均匀颗粒，分布于Vero细胞的细胞质中。

2.3 小批量衣原体阻断试验

2.3.1 安全性观察

接种剂量分别为:盐酸强力霉素:100.0μg/枚，盐酸环丙沙星:100.0μg/枚，接种7～8d鸡胚的卵黄囊腔，0.2ml胚（50ml卵黄液/枚），石蜡封口，在37～38℃孵育。对照组接种等剂量的灭菌生理盐水，每组各接种SPF鸡胚20枚，每天照蛋，直到鸡胚孵化，检查鸡胚的存活特点和雏鸡成活特点。排出药物污染问题和药物毒性。

2.3.2 小批量阻断衣原体观察

灯检:筛选7～8日龄的污染衣原体的种蛋1300枚，进行灯检，标识出种蛋的气室和胚胎所在的位置。

阻断前种蛋衣原体的检测:随机从发育鸡胚抽出20枚鸡胚，无菌操作，取出卵黄囊膜。在灭菌生理盐水中进行漂洗3次以上，用眼科钳取1×1cm大小的膜片，在载玻片上进行黏贴，甲醇固定10min。

吉姆萨染色和测定:先用pH为6.8的PBS将吉姆萨母液做10倍稀释，取稀释后液体覆盖细胞标本，置于湿盒中，置于37℃温箱中孵育30min后用蒸馏水冲洗，自然晾干。在显微镜下观察结果，阳性结果表现为:卵黄膜细胞呈天蓝色，衣原体包涵体呈紫红色的均匀颗粒，分布于膜细胞的细胞质中。计算种蛋卵黄膜上衣原体包涵体数量 （衣原体形成单位IFU）以及阳性率。

药物注射:分别以盐酸强力霉素 （100.0μg/枚）和盐酸环丙沙星 （100.0μg/枚），接种8日龄。接种后每天进行灯检（第8～12天），观察鸡胚发育特点和每1000枚种蛋的孵化率以及健康雏鸡的数量。

阻断后衣原体的检测:取药物阻断后6～8d存活的胚胎，无菌取出卵黄组织，在玻片上进行压片 （1×1cm大小），甲醇固定10min。以稀释的吉姆萨染色液进行染色，检查卵黄膜组织的衣原体包涵体。

评价指标:衣原体包涵体单位；出雏率；健康雏鸡率和1日龄体重。

2.4 大批量衣原体阻断试验

2.4.1 药物剂量选择

盐酸强力霉素和盐酸环丙沙星，注射剂量同上。

2.4.2 设备

采用荷兰Intervet连续鸡胚注射设备，测试连续注射给药方式。

2.4.3 接种方式

接种前8d照蛋，标记接种位置，0.2 ml/胚，卵黄囊腔接种。石蜡封口，在37～38℃孵育。盐酸强力霉素和盐酸环丙沙星分别接种10000和12000枚，对照组15000枚，每天照蛋，检查鸡胚的存活特点。

2.4.4 评价指标

出雏率、健康雏鸡率和1日龄体重；脐带吸收特点。

3 结果

3.1 药物阻断安全性评价

分别接种盐酸强力霉素和盐酸环丙沙星后，出雏率分别为90%和95%，对照组为90.0%。健雏率分别为94.4%、94.7%和94.1%，经统计学分析差异不显著。这提示两种药物处理后，对鸡胚发育和出壳雏鸡的健康无影响。结果见表1所示。

3.2 小批量药物阻断前后种蛋衣原体试验结果

对疑似感染衣原体种蛋卵黄膜进行检测，处理前高峰期种蛋和高峰后期种蛋衣原体单位 （IFU）分别为158和120，显示高峰期种蛋衣原体含量比较高。结果见表2所示。

分别接种盐酸强力霉素和盐酸环丙沙星后，14日龄测定鸡胚卵黄囊中衣原体单位分别为0.5和1.1，对照组 （药物未处理组）为180个衣原体单位。对处理后的鸡胚继续观察，强力霉素和环丙沙星组出雏率分别为95%和92.4%，显著高于空白对照组 （86.4%）。此外，出壳后雏鸡的平均体重分别为48.7g，49.2g和41.0g，这提示药物处理后雏鸡的生产性能显著提高，优于对照组。

同时，对出壳后雏鸡的卵黄囊残留进行随机检测，强力霉素和环丙沙星衣原体单位分别为0.6和1.8单位，显著低于空白对照组 （62衣原体单位）。结果见表3、表4和表5所示。

表1 药物处理后雏鸡的生产性能测定

表2 药物处理前种蛋衣原体平均含量测定

表3 药物处理后高峰期种蛋衣原体平均含量测定 （14日龄）

3.3 大批量药物阻断后雏鸡生产性能指标测定

大批量分别接种盐酸强力霉素和盐酸环丙沙星后，鸡胚的出雏率分别为93.6%和95.5%，对照组为82.3%。雏鸡出壳体重分别为49.2g，47.8g和42.5g。结果见表6。

此外，持续观察产蛋高峰期的生产性能，发现盐酸强力霉素和盐酸环丙沙星组的产蛋率分别为94.5%和92.3%，且产蛋高峰持续维持达到160d之久，对照组平均产蛋性能为77.5%，高峰期上升30d后，产蛋高峰开始下降到70%左右。考察产畸形蛋率指标，盐酸强力霉素和盐酸环丙沙星组分别为0.24%和0.27%，对照组为0.61%，差异显著。

表4 药物处理后雏鸡的生产性能测定

表5 小批量药物处理后雏鸡卵黄囊衣原体平均含量测定

表6 药物批量处理后雏鸡的生产性能测定

表7 药物批量处理后产蛋性能测定结果

再次从平均死亡率和淘汰率指标来看，对照组因为产蛋性能不佳，被迫提前淘汰，达到14.5%，相关强力霉素和环丙沙星处理组淘汰率分别为1.7%和1.5%，显著性低于对照组。结果见表7所示。

4 分析与讨论

4.1 药物阻断前后对种蛋衣原体和雏鸡携带衣原体的影响

禽衣原体能够寄生在很多动物体内，常见的有鸟类、哺乳动物、人等，并导致一系列的疾病。尤其在鹦鹉和鸽子体内，这种衣原体更为普遍。其传播途径主要有飞沫、分泌物、排泄物等。有学者在研究中指出，鸡胚感染也是衣原体的传播途径之一。

本次试验显示，盐酸强力霉素和盐酸环丙沙星接种处理鸡胚后，鸡胚卵黄囊中衣原体单位与对照组 （药物未处理组）呈现显著性降低。出壳的雏鸡出雏率、健雏率和出生体重显著性高于空白对照组，这提示药物处理后通过杀死鸡胚中的衣原体发育，导致雏鸡的生产性能显著性提高，这说明药物阻断衣原体在鸡胚中传播是安全的，而且也是非常有效，适合在基层种禽场进行技术推广。

4.2 药物阻断后对产蛋鸡生产性能的影响

将近40%患有输卵管囊肿疾病的蛋鸡体内都发现鹦鹉热衣原体的存在，揭示出输卵管积水严重程度以及鸡产蛋能力受到衣原体的直接影响。家禽免疫系统对这种衣原体具有较高的抗性，很多家禽即便感染了这种病菌，也没有出现任何疾病症状。但若感染衣原体的家禽体内存在家禽感染禽偏肺病毒 （aMPV）、鼻气管鸟疫杆菌 （ORT）、大肠杆菌 （E.coli）的话，衣原体就会开始威胁到家禽健康，甚至引发严重的流行性疾病。衣原体一旦感染蛋鸡群，造成30～50%高峰期产蛋鸡因为生产性能不良而被被迫淘汰。

通过强力霉素和环丙沙星药物处理后，高峰期产蛋率均超过90%，且产蛋高峰持续维持达到4个月之久，同时产畸形蛋数量显著性降低，死淘率也随着降低，这说明药物阻断方法对于家禽衣原体的控制是切实可行的，需要大力进行技术推广。但如果连续盐酸强力霉素和盐酸环丙沙星组进行药物阻断，衣原体产生的耐药性以及多重耐药性可能影响药物阻断的效果，今后试验中需要考虑其风险因素。

5 结论

本次小试和大批量试验显示，对种蛋确诊感染衣原体的鸡胚利用盐酸强力霉素和盐酸环丙沙星处理，剂量为100.0μg/枚，对鸡胚发育无不良反应。处理后出壳雏鸡的成活率、出生体重显著性升高。同时，高峰期产蛋性能显著性增加。利用该项技术可以实现阻断衣原体的垂直传播。