滨海盐土自生固氮菌的筛选及其对玉米幼苗生长的影响

王慧桥，陈为峰，诸葛玉平，贺明荣，王振林，张吉旺，董元杰*

(山东农业大学1 资源与环境学院，2 农学院；山东 泰安，271018)

滨海盐土自生固氮菌的筛选及其对玉米幼苗生长的影响

王慧桥1，陈为峰1，诸葛玉平1，贺明荣2，王振林2，张吉旺2，董元杰1*

(山东农业大学1 资源与环境学院，2 农学院；山东 泰安，271018)

为筛选有利于滨海盐土植株生长的自生固氮菌，以山东省滨州市无棣县滨海盐土为供试土壤，采用Ashby无氮培养基富集筛选自生固氮菌，乙炔还原法测定其固氮酶活性，玉米盆栽试验研究其固氮效能。以菌形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定菌种。从供试土壤中筛选得到菌株A2和B1，经鉴定为粘着剑菌Ensiferadhaerens，固氮酶活性分别为4.63和12.66 μmol·(h·mL)-1。通过玉米幼苗盆栽试验，菌株A2和B1对玉米幼苗株高、茎粗、鲜质量和干质量都有显著的增加，其中B1增加最显著。不同处理下植株氮含量均高于CK，其中B1菌株对玉米氮素含量增加效应最大。接种固氮菌剂均不同程度地提高了植株磷含量，其中B1菌株提高了36.22%，差异显著。说明B1菌株能够很好的促进滨海盐土环境下玉米对N元素和P元素的吸收，菌株B1固氮能力、竞争适应能力更强。筛选得到的2株菌固氮性能较高，具备作为生产固氮微生物肥料菌种的潜力。

自生固氮菌；玉米；生物固氮；滨海盐土；固氮酶活性

进入21世纪，我国农业生产既要求高产、稳产，又要求品质优良、环境友好[1]。长期以来，为追求农作物的高产，人们大量施用化肥和农药，使得土壤质量下降、生态环境恶化，严重影响了农业可持续发展与人类健康[2]。固氮微生物通过生物固氮把空气中的氮气转化成氨供给农作物利用，因其具有提高土壤肥力、改善农产品品质、绿色环保、能够自我更新增殖等特点，已成为新型肥料发展的重要方向之一[3]，世界各国学者对固氮微生物肥料的研究和应用都予以高度重视[4,5]。菌种是微生物肥料生产的基础，新型固氮微生物肥料的研制急需广谱、高效、抗逆的菌种。自生固氮菌较共生固氮菌的应用范围更广泛，可为小麦、玉米、水稻、蔬菜、棉花、果树等主要农作物提供氮素养分，在固氮微生物肥料方面有重要的应用价值[6～8]。因而，选育适用于广泛农作物品种、具备高效固氮和强竞争性的自生固氮菌菌种，研发固氮微生物肥料对生态农业的发展具有重要科学意义和应用价值。李文凤[9]从西藏林芝地区偏弱酸性土壤中分离出了固氮酶活达66.5 μmol·h-1的自生固氮菌；Jos Vanderleyden等[10]将自生固氮菌K.pneumoniae324接种小麦植株上，接种的小麦与对照相比，长得更高、茎秆更强健、叶绿素含量更高，其地下根系和地上苗系的干质量比对照高50%；刘剑君[11]从烤烟根际分离到了一株粪产碱菌N05制成固氮菌肥，在氮肥减施20%条件下，烟叶中氮含量仍很高。而有关在我国分布广泛的滨海盐土自生固氮菌筛选的研究却鲜见报道。

笔者从滨海盐土中筛选高效自生固氮菌，并对其进行生理生化试验及16S rDNA分子鉴定，再将其扩大培养制成菌剂，接种到盆栽玉米的盐碱土中，研究不同自生固氮菌对盆栽玉米幼苗生长的影响，筛选适应性强、固氮性能高的自生固氮菌，为固氮微生物肥料的研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

对照固氮菌微生物肥料购自苏柯汉(潍坊)生物工程有限公司，从中筛选已有的固氮菌菌种，作为对照。试验所用生化反应管、自生固氮菌培养基等耗材购自山东青岛海博化学试剂有限公司。

*通讯作者，男，博士，副教授。主要研究方向：土壤生态与植物营养。E-mail：yuanjiedong@163.com。

1.2 自生固氮菌分离与筛选

供试土壤采自山东省无棣县渤海粮仓试验示范基地，土壤类型是滨海盐土。采样深度为5～15 cm。将从田间取得的新鲜土样放入密封袋中，带回实验室过2 mm筛，4 ℃保存。称取混合土样6 g，放入盛有60 mL无菌水的三角瓶中，28 ℃的摇床180 r·min-1振荡2 h制成菌悬液。取上清液在试管中进行浓度梯度稀释，选取3个稀释度(10-4，10-5，10-6)的稀释液0.1 mL涂布于Ashby无氮固体培养基上，每个浓度重复3皿。将接种过的培养基放入恒温箱内，28 ℃恒温培养4 d，用于自生固氮菌的分离。购买的微生物菌肥也做同样处理。

4 d后，取出培养皿，统计固氮菌的菌落数量，仔细观察培养基上的菌落形态，镜检进行确认。挑取生长较大及不同形态的菌落划线纯化数次，至有规则单菌落出现。将单菌落接种到斜面培养基，直至菌落长起，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3 菌株复筛

1.3.1菌株固氮量测定 将初筛菌株分别接入固氮液体培养基扩大培养，28 ℃，180 r·min-1振荡培养4 d，采用半微量凯氏定氮法[12]测定各菌株菌液固氮量，复筛固氮量高的菌株。

1.3.2菌株固氮酶活性测定 固氮酶活性测定参考姜瑛等[13,14]的乙炔还原法，作如下改动：将复筛纯化后的菌株，接种在装有2 mL无氮液体培养基的青霉素小瓶中，28 ℃下培养48 h；将棉塞换为反口胶塞密封，用密封性好的注射器先从培养有菌的青霉素小瓶抽取2 mL空气，再注入2 mL C2H2，用胶布密封针眼；继续培养24 h后，取1 mL气样在气相色谱仪上测定C2H4峰值，标准气C2H4浓度为1.96 μg·mL-1。

采用GC-9A型气相色谱仪，其工作条件设置为：氢焰电离检测器FID，检测室气化温120 ℃；H2流量50 mL·min-1，压力20 kPa；色谱柱为2 m×3 mm玻璃柱，固体固定相为高分子多孔微球GDX-502，柱温70 ℃；载气高纯N2，流量20 mL·min-1，压力20 kPa；空气流量500 mL·min-1。

1.4 自生固氮菌鉴定

1.4.1形态学特征分析 将复筛菌株接种在Ashby无氮固体培养基上，观察菌落形态特征；挑取部分菌体细胞进行显微观察，观察菌株细胞形态、革兰氏染色等结构特点。

1.4.2生理生化特征测定 参考《常见细菌系统鉴定手册》[15]和《微生物学实验》[16]测定自生固氮菌生理生化特征。

1.4.3菌株16S rDNA序列分析 提取细菌基因组总DNA后，采用细菌16S rDNA通用引物27f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和1492r (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 进行16S rDNA的PCR扩增，扩增片断长度为1.5 kb。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，进入热循环，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72℃ 延伸10 min，共35个循环。取PCR产物在质量浓度为10 g·L-1的琼脂糖凝胶上进行电泳。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化。PCR产物由北京六合华大基因科技有限公司进行测序，并将获得的16S rDNA序列在GenBank数据库中进行比对，Blast搜索同源序列，使用DNAMAN 8.0软件，以Maximum-Likelihood法建立系统发育树。

1.5 盆栽玉米固氮菌效能研究

1.5.1供试材料 供试土壤取自山东省滨州市渤海粮仓试验示范基地，有机质质量分数7.30 g·kg-1，全氮质量分数0.67 g·kg-1，有效磷质量分数14.34 mg·kg-1，速效钾质量分数67.31 mg·kg-1，全盐质量分数2.23 g·kg-1，pH 7.87。供试玉米品种为“花糯1号”。

1.5.2试验设计与方法

接菌处理：将从土中复筛的两株具有较高固氮能力的菌(A2和B1)接种于无氮液体培养基(对从商品菌肥中筛选的菌C2做相同处理)，在28 ℃摇床中180 r·min-1恒温培养至对数生长期，在无菌操作台将菌液转入灭过菌的离心管中，5 000 r·min-1离心5 min，倒掉上清液，用无菌水反复洗涤(重悬-离心-去上清液)离心管底部菌体后，将其重悬于无菌水中，制成浓度大约为107cfu·mL-1的细菌悬液待用。

盆栽试验：设4个处理，(1)空白对照(CK)；(2)107cfu·mL-1菌剂A2处理(A2)；(3)107cfu·mL-1菌剂B1处理(B1)；(4)107cfu·mL-1菌剂C2处理(C2)。试验在山东农业大学植物营养实验室进行，采用直径13 cm，高14 cm的塑料盆，每盆装土1 kg。每盆种植5颗经催芽处理的种子，按106cfu·g-1土的接种量(即每盆接种100 mL)接种供试菌株，空白对照接种等量无菌水。每个处理设置5次重复，每天浇无菌水以保持土壤含水量的稳定。出苗20 d后收获、分析并测试。1.5.3植株生长情况测定 株高、鲜质量和干质量采用常规直尺测量和天平称量方法。植物氮、磷、钾测定方法：全氮采用H2SO4-H2O2消煮-凯氏定氮法测定；全磷采用H2SO4-H2O2消煮-钼锑抗比色法测定；全钾采用H2SO4-H2O2消煮-火焰光度法测定[17]。叶绿素含量采用乙醇提取、紫外分光光度法测定[18]。

1.6 数据处理

采用Excel 2003软件处理数据和绘表，DPS 7.05软件进行数据统计分析，最小显著极差法(LSD)进行差异显著性检验(p<0.05)。

2 结果与分析

2.1 自生固氮菌筛选

试验从土壤中共分离获得17株自生固氮菌，挑选其中菌落数较多、较典型菌落进一步分离纯化及传代培养，共筛选获得仍可保持原菌落特点的固氮菌4株(A1，A2，B1，B2)。从对照菌肥中筛选得到固氮菌2株(C1，C2)。将其分别转入固氮菌液体培养基，测定各菌株固氮量。结果表明，4株菌都具有一定的固氮能力(图1)。从滨海盐土中筛选的菌株，B1和A2固氮能力最强，固氮量分别为1.94和1.32 μg·mL-1，培养基含氮量为0。而从商品菌肥中筛选的菌株C1和C2固氮能力差异不显著，分别为1.06和1.07 μg·mL-1。依据该结果，将A2，B1和C2作为复筛菌株，对其进行固氮酶活性测定，分别达到了4.63，12.66和5.72 μmol·(h·mL)-1，后续对此3株菌进行生理生化试验、16S rDNA分析鉴定及盆栽玉米试验。

图1 自生固氮菌固氮量比较

2.2筛选菌株的形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析

经平板划线、革兰氏染色，观察菌株培养特征及菌体形态特征。选育的菌株A2在无氮培养基平板上形成圆形、灰白色不透明的隆起菌落，直径1～3 mm，表面光滑粘稠，湿润有光泽，质地不均匀，边缘整齐(图2 a)。菌体呈杆状，单个、成对或不规则的堆状(图2 d)。革兰氏染色呈红色。

菌株B1菌落直径1～2 mm，呈圆形、较小、半透明、灰白色、隆起菌落，表面光滑湿润，粘稠，边缘整齐，质地较均匀(图2 b)。菌体呈杆状，单个，成对或成堆排列(图2 e)。革兰氏染色阴性呈红色。

菌株C2形成的菌落较大、无色透明、扁平，表面光滑湿润，粘稠似油滴，边缘较整齐，并且能分解该培养基呈透明(图2 c)。菌体较小呈短杆状(图2 f)。革兰氏染色红色。

3株自生固氮菌所具有的酶系统不相同，对营养基质的分解能力也不一样。A2脲酶反应强烈，证明该菌具有较强的分解尿素的能力；淀粉水解实验呈阳性反应，说明该菌可以产生分解淀粉的酶；其他的生理生化反应呈阴性反应。B1尿素反应较强烈；其明胶液化反应呈阳性，说明该菌具有明胶酶，可以将明胶水解；触酶试验呈阳性，证明其具有过氧化氢酶；该菌具有淀粉水解酶，淀粉反应呈阳性。C2能利用广泛的碳源，尿素反应呈阳性，可以水解明胶，能分解过氧化氢。具体生理生化指标如表1所示。

图2 自生固氮菌菌落与菌体形态

对筛选得到的3株菌，利用细菌16S rDNA通用引物27f和1492r对自生固氮菌基因组DNA进行扩增，得到3条1 500 bp左右的特异性条带(图3)。经16S rDNA序列分析和NCBI数据库在线比对，结果表明A2和B1与Ensiferadhaerens同源性分别达到95.7%和95.8%，C2与Enterobacteramnigera同源性达到100%。采用NCBI数据库高同源性菌株进行的16S rDNA系统学发育树分析也表明，A2和B1与Ensiferadhaerens亲缘关系较近，而C2与Enterobacteramnigera亲缘关系较近(图4)。根据菌株的形态特征、生理生化特性，以及16S rDNA基因比对结果，参照《常见细菌系统鉴定手册》[15]，菌株A2和B1被初步鉴定为粘着剑菌Ensiferadhaerens，菌株C2被初步鉴定为肠杆菌科Enterobacteramnigera。

表1 固氮菌生理生化特征

注：“+”，阳性反应或长势良好；“-”，阴性 反应或不生长。

图3 筛选自生固氮菌16S rDNA琼脂糖凝胶电泳图谱

图4 根据16S rDNA序列分析构建的系统发育树

2.3 不同自生固氮菌对玉米幼苗生长及养分积累量的影响

将菌剂接入玉米盆栽土壤，研究接种菌剂对玉米幼苗生长的影响。20 d后，接种菌剂的玉米植株生长健壮，叶片长，叶片色泽浓绿。由表2可知，添加菌剂的3个处理玉米株高、茎粗和鲜质量含量均显著高于对照。添加菌剂A2和B1的玉米株高均显著高于菌剂C2处理，且B1处理下玉米株高比A2处理提高了6.71%，差异达到显著水平。菌剂B1处理玉米茎粗、鲜质量和干质量显著高于A2和C2处理，较C2分别增加5.56%，12.29%和7.50%。A2处理玉米茎粗和鲜质量较C2处理分别增加了2.78%和3.04%。说明本试验筛选得到的2菌株优于试验选用商品菌肥，并且以菌株B1试验效果更好。

表2 固氮菌剂对盆栽玉米生长指标的影响

注：同一列中不同字母表示差异显著(p<0.05)。

叶绿素直接参与光能吸收和能量的转化，其含量的高低直接影响玉米的光合能力。由表2可知，不同菌剂处理均不同程度地提高了玉米叶绿素含量，各处理玉米叶绿素的质量分数由高到低的顺序表现为： A2，B1，C2。 A2和B1处理较C2分别增加了6.12%和2.55%，但差异不显著。

由表3可见，不同处理下植株氮含量均高于CK，但差异未达显著水平。其中B1菌株对玉米氮素含量增加最大，各菌剂处理之间玉米N的质量分数由高到低的顺序为：B1，C2，A2。接种固氮菌剂均不同程度地提高了植株磷含量，其中B1菌株与对照相比提高了36.22%，差异达到显著水平。综上说明，B1菌株能够很好地促进滨海盐土环境下玉米对N和P元素的吸收。

表3 接种固氮菌剂后玉米植株中氮磷钾的质量分数

3 结论与讨论

自生固氮菌是一类在土壤或培养基中，可以固定空气中分子态氮的细菌。它们不与其他生物形成共生体系，并以土壤有机质和矿质养分为碳源和养料进行生物固氮作用。这类细菌固氮的全过程都在其自身细胞中进行。所固定的氮在细菌死亡腐解后释放到土壤中供植物利用。一般自生固氮菌的固氮能力较共生固氮菌低，但由于其不受宿主等因素限制，其生产和使用都很方便。

自生固氮菌的固氮研究远不如豆科植物共生固氮菌的研究那样深入[19]。研究发现大部分自生固氮菌都可以促进植株生长。Bahrani 等[20]研究发现接种褐球固氮菌可以提高冬小麦(Triticumaestivum)的籽粒产量与蛋白质含量。Kizilkaya 等[21]采用分离于土耳其安纳托利亚北部的11株褐球固氮菌接种春小麦，结果表明褐球固氮菌可以促进春小麦生长并提高植株氮含量。接种固氮微生物为农作物提供氮素养分具有实践指导意义[22]。

试验用土未经灭菌，试验条件更接近玉米生长的自然条件，所得结果对应用该固氮菌制作微生物固氮菌肥更有参考价值。本试验通过观察细菌形态和生理生化特征以及16S rDNA基因序列分析，鉴定得出A2和B1均为剑菌属粘着剑菌Ensiferadhaerens，C2为肠杆菌属Enterobacteramnigera。试验结果表明经过A2或B1处理的玉米幼苗期形态指标与生理指标均高于C2处理。在株高方面，接种菌剂都可促进其生长，可能是由于固氮菌除了固氮之外，分泌的植物生长调节物质，刺激了植物根系的生长发育，这与李春俭等[23]的研究结果基本一致。并且数据表明A2和B1菌株在单位时间内固氮量比C2分别增加23.15%和81.49%，这说明在无棣滨海盐土中提取的固氮菌其固氮能力要强于所购买的固氮菌肥中的固氮菌，且更加适合盐分含量较高条件下玉米幼苗的生长。

接种的2株自生固氮菌A2和B1均能有效提高玉米幼苗叶绿素含量，可能是分泌生长调节物质的刺激作用，提高了玉米幼苗根系活力，从而提高了植株光合效率。国内外研究发现固氮菌株促进植物生长的重要原因之一是其能分泌植物生长调节物质。Okeny[24]研究发现，接种巴西固氮螺菌对植物根系的促生作用明显高于接种其IAA缺失菌株(对照)；陈明[25]报道，接种固氮菌与施用外源植物激素具有相类似的效应，对粪产碱杆菌(Acaligenesfeacalis)的研究发现，该菌具有分泌IAA的功能。根际中的自生固氮菌可以固定空气中的氮气，供给植物无机及有机氮源。作为一类特殊的固氮微生物，自生固氮菌在土壤中与植物和其他微生物存在一定的互作关系，如自生固氮菌代谢产物可供其他土壤微生物的生长。其次，自生固氮菌可以促进植物根系的生长发育，如促进植物根系生物量提高和根系分叉数目增多，进而使得根系活力增加，根系分泌物增多，加速土壤养分转化。此时，根际微域环境中其他细菌可利用的生存附着空间和能量物质(植物残体或者根系分泌物、菌丝分泌的蛋白类物质)显著提高，从而细菌数量有所增加。在根际土壤中，自生固氮菌固定氮气的速率要比在缺少植物的土壤中快的多，这是因为植物一方面能有效地吸收固定铵态氮，另一方面植株根分泌的一些有机物可作为营养物质供自生固氮菌利用。

我国属于农业大国，化学肥料每年的施用量非常大，尤其是氮肥出现严重的滥用现象[26]。而玉米作为一种对氮肥需求量很大的作物，在实际生产过程中也不可避免地对氮肥有着很强的依赖性。由于氮肥的大量施用会对土壤造成一些不可逆的损伤，所以探究一种新型的无污染的氮肥施用方式势在必行。试验分离获得的2株自生固氮细菌，将为研制、开发新型生物氮肥提供菌种资源为其在大田的实际应用奠定基础。试验也将进一步研究菌株的固氮能力和固氮条件，以期为该菌在滨海盐土的下一步应用提供科学依据和参考。

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(责任编辑：朱宝昌，陈于和)

Abstract:The objective of the study was to isolate and screen the azotobacter which was beneficial to plant growth in coastal saline soil. The test soil sample was marine solonchak in Wudi, Shandong province. Ashby nitrogen-free medium was used to isolate nitrogen-fixers. Nitrogenase activity was determined by acetylene reduction assay. Inoculation effects were tested with corn pot cultured in greenhouse. Strain identification was carried out based on morphology and physiology, biochemical tests and 16S rDNA sequences analysis. Two strains termed as A2 and B1 with relative high nitrogenase activity (4.63 and 12.66 μmol·h-1·mL-1) were isolated, which were both identified asEnsiferadhaerens. The pot trial showed that the biomass of maize seedlings inoculated with two trains significantly increased compared with the control, while B1 treatment showed the best beneficial effects. The nitrogen content of corn was promoted after inoculation and the value caused by B1 were raised greatly. The phosphorus content of corn was improved by the inoculation of nitrogen-fixing bacteria and the difference of B1 was significantly increased by 36.22%. This indicated that strain B1 could promote absorption of both N and P in corn in coastal saline environment. The results revealed the strain B1 had stronger competition ability than the strain A2. However, both strains B2 and A1 had strong nitrogen-fixing ability and significant effect in promoting growth of corn, which was possible to be developed further as the excellent strains for microbial fertilizer production.

Keywords:azotobacter; corn; biological nitrogen fixation; seashore saline soil; nitrogenase activity

IsolationandIdentificationofAzotobacterandItsInfluenceonGrowthofCornSeedlingsinSeashoreSalineSoil

WANG Huiqiao1, CHEN Weifeng1, ZHUGE Yuping1, HE Mingrong2, WANG Zhenlin2, ZHANG Jiwang2, DONG Yuanjie1

(1 College of Resources and Environment, 2 College of Agronomy; Shandong Agricultural University, Tai’an Shandong, 271018, China)

S143.1; S513

A

1672-7983(2017)02-0060-08

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2017.02.010

山东省重点研发计划(项目编号：2016CYJS05A02)；史丹利功能性生物肥料基金项目(项目编号：380078)；山东省自主创新及成果转化专项(项目编号：2014ZZCX07402)。

2017-06-26

王慧桥(1992-)，女，硕士研究生。主要研究方向：土壤生态与植物营养。