悬浮固化分散液相微萃取-高效液相色谱/串联质谱法 测定环境水样品中6种雌激素

李 锦， 张丽君， 董南巡， 高仕谦， 顾海东， 张占恩

(1.苏州科技大学环境科学与工程学院，江苏苏州 215009； 2.苏州科技大学江苏省环境科学与工程重点实验室，江苏苏州 215009； 3.江苏省水处理技术与材料协同创新中心，江苏苏州 215009)

环境雌激素是一类可扰乱人体及动物正常生命活动的环境污染物[1 - 2]，有研究表明女童性早熟，妇女乳腺癌和子宫癌发病率的上升和男性前列腺癌均与雌激素的残留有关[3 - 4]。近年来，雌激素在污水、地表水、甚至于饮用水水源、自来水厂出水以及配水管网中被多次检出。因此，测定环境水样中痕量雌激素十分重要。常用的富集雌激素的样品预处理方法有固相萃取[5]、基质固相分散萃取[6]、分散液相微萃取(DLLME)[7]等。目前，有关雌激素的样品预处理方法以固相萃取为主[8]，而固相萃取较为耗时、耗费大量有机溶剂。DLLME是近年发展起来的一种新型样品前处理技术。该技术具有操作简便、装置简单、快速、高效等优点，但是DLLME多用卤苯、氯仿、二氯乙烷、四氯化碳等毒性较大的含卤萃取剂[9]。Leong和Huang等[10]在DLLME的基础上于2008年提出一种新型分散液相微萃取技术，即悬浮固化分散液相微萃取(DLLME-SFO)，该技术是将分散液相微萃取和悬浮固化液相微萃取两种技术结合[11]，并且优于这两种前处理方法[12]。悬浮固化分散液相微萃取技术已广泛应用于水中氯酚[13]、有机氯农药[14]、金属铜[15]等的测定。

本文选用对人和环境危害较小的绿色环保不含氯元素的长链脂肪醇作为萃取剂，同时以中性离子表面活性剂作为分散剂。实验结果表明，本文所建立的悬浮固化分散液相微萃取-高效液相色谱-串联质谱法(DLLME-SFO-HPLC-MS/MS)能快速高效的检测环境水样中的雌激素残留。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Ultimate 3000型高效液相色谱仪，TSQ Quantum Ultra EMR三重四极杆质谱仪(美国，Thermo)；800型离心机(上海精科实业有限公司)；Sk-1型快速混匀器(金坛市科析仪器有限公司)；KQ-100E型超声波仪(昆山市超声仪器有限公司)。

标准品壬基雌酚、双酚A、己烯雌酚、雌酮、雌二醇、雌炔醇均购自于德国Dr.Ehrenstorfer，纯度均大于98.0%，用甲醇配成100 mg/L混合标准储备液，于冰箱中4 ℃下保存。1-十二醇、十一醇、2-十二醇、正十六烷均购自于上海阿拉丁试剂有限公司，纯度均大于99.0%。十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)、曲拉通 X-100(Triton X-100)、司班20(Span 20)、吐温80(Tween80)，乙酸、乙酸钠，氯化钠均为分析纯。色谱纯甲醇、乙腈均购自于美国Tedia。实验室用水为超纯水。

1.2 色谱-质谱条件

色谱柱：DB-C18反相色谱柱(50×3.0 mm，1.8 μm)；流速300 μL/min；进样量10 μL；柱温25 ℃；流动相为水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱程序：0.0～4.0 min，20～90%B；4.0～7.0 min，90%B；7.0～7.5 min，90～20%B；7.5～10 min，20%B。

采用加热电喷雾负离子源(H-ESI)，选择反应监测模式(SRM)。喷雾器电压为3 kV，喷雾器温度为300 ℃，鞘气和辅助气压力分别为172 kPa和69 kPa，离子传输毛细管温度为350 ℃，碰撞气压力为0.2 Pa，进样方式为自动进样。质谱分析参数见表1。

表1 6种雌激素的母离子、子离子和碰撞能量

*quantitative ion.

1.3 萃取过程

吸取10 mL经0.45 μm滤膜过滤后的环境水样，置于带塞玻璃离心管中，调节溶液pH至7.0，再加入萃取剂1-十二醇90 μL和分散剂Triton X-100 250 μL的混合溶液至离心管中，超声3 min形成乳化溶液，4 000 r/min下离心，分层，得1-十二醇上层萃取相。萃取完成后，将离心管置于4 ℃的冰箱中，冰浴10 min后取出，待凝固点为24 ℃的1-十二醇凝结成固体，用特制的小勺将其取出并置于进样瓶中，最后加入甲醇溶解定容至300 μL，经0.22 μm有机滤膜过滤至内置内衬管的进样瓶中，取10 μL进行HPLC-MS/MS检测。

2 结果与讨论

2.1 萃取条件的优化

2.1.1萃取剂的选择萃取剂的类型对于DLLME-SFO的萃取率具有显著性影响。由于雌激素的辛醇/水分配系数较高，使其更易溶于长链醇(烷)类，适于用DLLME-SFO方法进行富集。本文试验了1-十二醇、十一醇、2-十二醇、正十六烷作为萃取剂，考察萃取效率，结果如图1所示。 以1-十二醇作为萃取剂时雌激素的回收率较好。由于1-十二醇与雌激素氢键作用较强，增强了其与雌激素作用，因此选择1-十二醇作为萃取剂。

2.1.2分散剂的选择表面活性剂同时具有亲水和亲油基团，能起到分散作用且毒性比常用分散剂要低，本文选用阳离子表面活性剂 CTAB和TTAB、阴离子表面活性剂SDS和中性离子表面活性剂Triton X-100、Span 20和Tween 80作为分散剂。由图2可知，分散剂为Triton X-100时，萃取效果较好。雌激素具有弱极性，因此中性离子表面活性剂对雌激素具有较好的萃取作用。

2.1.3萃取剂和分散剂体积及萃取时间的选择采用正交试验法，选择L16(34)，按照三因素四水平实验安排，考察三因素1-十二醇体积、Triton X-100体积、萃取时间；四水平中1-十二醇体积分别为60、75、90、105 μL；Triton X-100体积分别为150、200、250、300 μL；萃取时间分别为1、3、5、7 min，进行条件选择。实验结果表明，当萃取剂1-十二醇用量为90 μL、分散剂Triton X-100体积为250 μL、萃取时间为3 min时萃取效果最好。

图1 萃取剂类型对萃取效率的影响Fig.1 Effect of extractants on extraction efficiency Dispersive solvent:200 μL 0.025 mol/L Triton X-100;Extractant volume:100 μL;Salt:5%;pH=6.0;Ultrasonic time:5 min;Centrifugation time:7 min.

图2 分散剂种类对萃取效率的影响Fig.2 Effect of dispersants on extraction efficiency Extractant:100 μL 1-dodecanol;Dispersive solvent:200 μL 0.025 mol/L;For other conditions,seeFig.1.

图3 pH值对萃取效率的影响Fig.3 Effect of pH value on extraction efficiency Extractant:90 μL 1-dodecanol;Dispersive solvent:250 μL Triton X-100(0.025 mol/L);pH=7.0;Ultrasonic time:3 min;Centrifugation time:7 min.

2.1.4水相的pH和离子强度的影响实验对环境水样pH值在4.0～7.0范围内进行考察。由图3可知：水样pH值在7.0左右时，萃取效果最好，原因是溶液pH值小于目标物pKa值三个单位时[16]，目标物主要以中性分子形式存在，利于萃取，而6种雌激素pKa值在9.5～10.8[17]之间，正好符合本实验结果。

适宜的离子强度能使待测物更好的溶于萃取剂中，从而提高萃取率。考察了NaCl浓度分别为0%、5%、10%、15%、20%时的萃取回收率，实验结果表明，不加盐时回收率最高，原因是6种雌激素均含有酚羟基，具有一定电离能力，而NaCl的加入稳定了这种电离能力，因而降低萃取效率。

2.2 线性关系、检出限、加标回收率

用甲醇稀释雌激素配制成一系列标准混合溶液，按上述1.3重复操作，用超纯水代替水样，以混合标准溶液浓度(x，μg/L)为横轴，相应的待测物峰面积(y)为纵轴，绘制标准曲线，得到线性范围、线性方程、线性相关系数(r)，检出限(LOD)按信噪比(S/N)=3计算，定量限(LOQ)按S/N=10计算。在金鸡湖(水样1)和阳澄湖(水样2)中分别添加高、中、低三种不同浓度的混合标准溶液进行检测，每个添加水平样品重复测定6次，得出回收率以及相对标准偏差。结果见表2。

表2 6种雌激素的线性范围、线性方程、相关系数、检出限、加标回收率

(续表2)

EstrogenLinear range(μg/L)Linear equationrLOD(μg/L)LOQ(μg/L)Spiked(μg/L)Sample water 1Recovery(%)RSD(%,n=6)E20.05-50y=1445.2x+175.030.99980.0120.036598.12.32595.94.45099.22.4EE20.1-50y=758.79x+356.640.99970.0240.072597.31.92599.07.05099.83.3

2.3 与其它方法的对比

通过与其它前处理和检测方法作比较，可以看出DLLME-SFO萃取时间较短，回收率较高，检出限较低，如表3所示。

表3 不同文献中的雌激素测定结果的对比

2.4 环境水样分析

利用该方法对苏州市金鸡湖和阳澄湖水实际样品进行了测定。结果显示，金鸡湖水中含有壬基雌酚浓度为0.15 μg/L、双酚A浓度为0.02 μg/L、雌酮浓度为0.01 μg/L。结果见图4。阳澄湖水中含有壬基雌酚浓度为0.20 μg/L、双酚A浓度为0.04 μg/L、己烯雌酚浓度为0.42 μg/L、雌酮浓度为0.12 μg/L。

图4 金鸡湖水样中3种雌激素Fig.4 Three estrogens in Jinji lake

3 结论

本文建立了悬浮固化分散液相微萃取结合高效液相色谱串联质谱法测定自然水体中6种痕量雌激素的方法。悬浮固化分散液相微萃取技术应用范围较广，所用分散剂为表面活性剂，用量较少，对环境污染较小。该方法装置简单，操作简便，溶剂用量较少，能快速高效测定环境水样中残留的雌激素。