微孔板化学发光法检测碱性磷酸酶技术的建立

刘 欢, 胡亚萍, 高习习, 王 鹏, 丁 凡, 王钦富

(大连大学生命科学与技术学院，辽宁大连 116622)

碱性磷酸酶(Alkaline Phosphates,ALP)是一种广泛存在于人体、动物、植物及微生物体内的膜结合蛋白，在碱性条件下具有催化活性。ALP直接参与磷酸基团的转移和代谢等生理过程，对体内钙磷的吸收与代谢、维持体内适宜钙磷比例，以及动物的骨化过程有着极其重要的作用[1]。血清中的ALP活力增高可见于阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸型肝炎、肝癌等肝胆疾病，因此ALP酶活力测定常作为肝胆疾病的临床辅助诊断指标。另外，ALP是乳中天然存在的一种酶，该酶作为一种热处理强度指标被广泛应用于评价牛奶巴氏杀菌是否彻底[2]。

目前，检测ALP的主要方法有电化学法[3 - 4]、荧光分光光度法[5 - 7]、紫外-可见分光光度法[8 - 9]、化学发光法[10 - 12]等。电化学法是以磷酸苯酯为底物，通过TYR和电活性产物之间能够进行反复连续的反应，化学反应信号得到增强，从而测定ALP活性。该方法较为快捷方便，但是选择性较差，反应条件不易控制。荧光分光光度法采用的是动力学连续性检测，在作用时间内对产生的荧光增加量与标准曲线对比，计算相应的酶活力，方法准确、简便、灵敏度高，但用时较长，不易测量。紫外-可见分光光度法是在碱性磷酸酶的催化作用下，生成一种蓝色的化合物靛酚，通过与一套标准颜色进行对比或者用分光光度计检测，得出ALP的活性。虽然这种方法快速、方便，但苯酚极易受到污染，造成假阳性结果，且结果判断具有主观性，影响测定准确度。本实验采用的化学发光法是利用发光底物APLS能被ALP迅速水解，且水解产物能够持续发光，通过多功能酶标仪检测发光强度，以测定ALP活性。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

pH计(上海天达公司)；生化培养箱(Bluepard 公司)；Synergy2多功能酶标仪(BioTek 公司)。

ALP标准品(Sangon Biotech 公司)酶活力是5 000 U/mg；ALP标准品稀释液为10 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)，1 mmol/L MgCl2，50%甘油。APLS底物液(InnosepBio 公司)；白色96孔微孔板(Mabtech 公司)。

1.2 实验方法

微孔板化学发光法检测ALP的操作步骤是在白色96孔微孔板中加入ALP及其底物APLS，孵育后，用多功能酶标仪检测其发光强度，进而测量ALP的活性(△RLU)。仅加入APLS底物的发光光子数为RLU0，ALP作用产生发光光子数为RLU,△RLU=RLU-RLU0。

2 结果与分析

2.1 孵育温度对化学发光体系的影响

1 U/L ALP标准品与200 μL、pH=9.5的APLS底物液在温度分别为27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃、47 ℃、52 ℃下孵育10 min后，体系的△RLU与温度的关系见图1。可见在37 ℃处达到峰值。因此，ALP最适反应温度为37 ℃。

2.2 APLS底物液体积对化学发光体系的影响

1 U/L ALP标准品与pH=9.5、体积分别为25、50、100、150、200 μL的APLS底物液，在37 ℃条件下孵育10 min，体系的△RLU与APLS底物液体积的关系见图2。结果表明△RLU随APLS底物液体积增大而增大，当体积大于200 μL时，△RLU达到平台，因此，最适APLS底物液体积为200 μL。

2.3 pH对化学发光体系的影响

1 U/L ALP标准品与200 μL、pH分别为8、8.5、9、9.2、9.5、10、11的APLS底物液，在37 ℃条件下孵育10 min，其发△RLU与pH的关系见图3，结果显示在pH=9.5时，△RLU最大。因此，APLS法检测ALP反应体系的最适pH值为9.5。

2.4 孵育时间对化学发光体系的影响

在酶促反应中，孵育时间对ALP催化底物APLS的水解反应速度影响很大。从图4中可以看出，△RLU在孵育2、10、20、30、40、50、60 min等不同时间点检测时呈现曲线关系，当时间为10 min时，△RLU最大。因此，ALP与底物APLS的最佳反应时间是10 min。与赵启仁等[11]发光法检测ALP和茹柿平等[2]电化学法检测ALP的时间为20 min相比，本文建立的化学发光法所用时间缩短。

图1 温度对于反应体系的△RLU的影响Fig.1 Effect of temperature on △RLU of reaction system

图2 APLS底物体积对反应体系△RLU的影响Fig.2 Effect of APLS volume on △RLU of reaction system

图3 pH对反应体系△RLU的影响Fig.3 Effect of pH on △RLU of reaction system

图4 反应时间对反应体系的△RLU的影响Fig.4 Effect of incubation time on △RLU of reaction system

2.5 灵敏度和线性范围

0.0001～1 000 U/L 不同酶活力的ALP 与pH=9.5、200 μL APLS底物在37 ℃条件下孵育10 min。微孔板化学发光法检测，ALP酶活力在0.01～1 U/L范围呈现良好的线性关系，线性回归方程为：△RLU=7.1478x+0.25857,相关系数为0.9918。

3 结论

本文利用一种新的发光底物APLS，建立微孔板化学发光法检测ALP并进行条件优化。优化最适反应条件为：微孔板上每孔加200 μL APLS，在pH=9.5、37 ℃条件下与待测ALP反应10 min。结果表明检测ALP线性范围是0.01～1 U/L，相对于光吸收法等本文方法灵敏度更高，且操作简便易行。