基于碳点标记的（1-3）-β-D葡聚糖的荧光检测方法

葛宇新，张洋，田振华，于源华，郭瑞，张昊

（1.长春理工大学 校医院，长春 130022；2.长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022）

基于碳点标记的（1-3）-β-D葡聚糖的荧光检测方法

葛宇新1，张洋2，田振华2，于源华2，郭瑞2，张昊2

（1.长春理工大学 校医院，长春 130022；2.长春理工大学 生命科学技术学院，长春 130022）

血清中（1，3）-β-D葡聚糖（βG）的含量已经成为临床上检测侵袭性真菌感染的指标，利用原核表达并纯化获得能够与βG特异性结合的美洲鲎属G因子α亚基片段a（Gαa）蛋白，将Gαa蛋白与碳点偶联获得生物荧光传感器“碳点/Gαa蛋白”，建立基于碳点标记的βG荧光检测方法。经测定该传感器的最佳的激发波长为360nm，其发射波长为470nm，且荧光强度与βG浓度呈正线性相关，该检测方法线性范围是9.375～150pg/mL，最低检测限为9.375pg/mL，批间、批内精密度均不小于5%，准确度（回收率）在97%～102%之间，该方法灵敏、快速、成本低，具有广阔的应用前景。

（1，3）-β-D葡聚糖；美洲鲎属G因子α亚基片段a特异性蛋白；碳量子点；真菌感染

近三十年来，随着器官移植、肿瘤化疗、免疫抑制剂使用、创伤性医疗操作等的不断增多，侵袭性真菌感染（invasive fungal infection，IFI）的发病率和病死率显著上升。美国非艾滋病患者中致死性真菌感染的发病率逐年上升［1］。

真菌的细胞壁主要成分为（1，3）-β-D葡聚糖（βG）。当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理，βG从胞壁中释放出来，使血液及其它体液中βG含量增高。在临床上，正常人体血液中的（1，3）-β-D葡聚糖含量应小于10pg/mL，若含量大于20pg/mL，可诊断此病人患有侵袭性真菌感染，当含量在10pg/mL与20pg/mL之间，表明该检验品有（1，3）-β-D葡聚糖存在，此人存在被侵袭性真菌感染的危险［2，3］。生物标志物（G和GM试验）分别被列入真菌诊断和治疗的指南，欧洲癌症治疗研究组织和美国国家过敏症与传染病研究所霉菌病研究组批准用于真菌诊断［4］。因此对βG进行测定，实现真菌感染的早期诊断并对检测结果为阳性的患者及时进行治疗，是提高患者生存质量的关键［5-6］。

国内外关于检测真菌（1，3）-β-D葡聚糖的方法主要为鲎试剂法：鲎试剂（鲎的血细胞提取物）在1983年首先收载于美国药典。Fungitec-G glucan试剂主要成分是东方鲎的细胞裂解产物，其判断标准为 20ng/L［7］；而 Glcatell试剂则使用美洲鲎的细胞裂解产物作为主要原料，使用的判断标准为60ng/L［8-9］。这种检测方法灵敏度很高，但是鲎血属于天然材料，易出现资源的枯竭，目前在某些地区鲎已经被列为二级保护动物。由于鲎试剂的成本比较高，且需对样品进行前处理，测定时间长［10-11］。因此建立灵敏、简便、低成本检测（1，3）-β-D葡聚糖的测定方法，对真菌感染早期诊断、治疗效果和康复判断具有重大意义。

近年来，荧光碳点（CDs）以高稳定性、低毒性、低成本的优势，在各种生物检测领域里起到很大的作用，荧光碳点具有独特的性质，碳点在特定的激发波长下会产生荧光，这种荧光在碳点与其他物质结合后会随着所加的物质浓度的上升而出现荧光峰值的上升或是下降，或者荧光峰值会出现蓝移或红移［12-14］。研究这种现象的规律与检测所加物质浓度呈一定的关系，从而通过此规律达到对待检测物未知浓度的检测。

碳量子点因其粒径小（1-10nm），从而具有独特优越的光学、电子和表面可修饰性等性质，已成为纳米生物光子学领域的新贵，被广泛应用在生物标记领域。高质量的碳量子点溶液具备以下特点：广泛的尺寸范围、较窄的尺寸分布、良好的稳定性以及高荧光性。

通过鲎试剂可以检测真菌感染，表示鲎血中存在某种特异性蛋白可以与真菌细胞壁的βG结合，因此在基因组文库中筛选出能够与βG特异性结合的蛋白质基因序列，利用基因重组技术，克隆该段基因，通过原核大量表达Gαa蛋白，过亲和层析Ni柱纯化蛋白，得到高纯度蛋白质可以与碳点通过脱水缩合反应结合，构建生物荧光传感器，用于检测样品中（1，3）-β-D葡聚糖的含量。当特异性蛋白质与碳点结合物浓度固定时，样品的荧光值的增加量在一定范围内与样品所含βG量呈正相关。

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

本实验用的实验仪器包括：Synergy2荧光酶标仪（美国BioTek公司）；96孔微孔黑板（美国Corning公司）；RF-5301PC荧光分光光度计（日本岛津公司）；HZQ-F160全温振荡培养箱（哈东联公司）；Tecnai G2 20透射电镜（美国FEI公司）。

本实验用的实验试剂包括：工程菌E.coli BL21-pET-15b-Gαa（上海生物工程有限公司构建）；氨基修饰的碳点（苏州大学赠予）；（1，3）-β-D葡聚糖标准品（购自上海源叶生物有限公司）；IPTG、N-乙基-N’-（3-二甲基氨丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）（购自Sigma-Aldrich）；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 重组菌的表达纯化和纯化

根据GenBank：AB547712.1上登记的美洲鲎属G因子α亚基片段a（Gαa）的基因序列，大小是1251bp，合成 BL21-pET-15b-Gαa的工程菌。将含有重组质粒的E.coli BL21菌株接种到LB液体培养液中表达，表达条件是20℃，160rpm，LB培养基中加入IPTG至终浓度为1mM，培养48小时。培养后，将培养液进行离心分离，回收所得的沉淀物（菌体）。将沉淀物用PBS洗涤2次，然后用NPI-1（PBS，含有咪唑1 mmol/L，pH 7.4）重悬菌体，加入溶菌酶，通过反复冻融和超声破碎，离心取上清。过Ni柱时按照上海悦克生物科技有限公司的Ni-NTA亲和层析柱的说明书纯化目的蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测。

1.3 碳点性质

用透射电镜扫描碳点，观察碳点的形貌和大小。

用荧光分光光度计，检测1mL的碳点，在不同的激发波长下，观察荧光光谱的变化，最终找到规律并选出最佳的激发波长。

将碳点按照体积梯度稀释，在紫外照射下用肉眼观察样品荧光光强的变化。用荧光分光光度计，输入最佳的激发波长，得到的荧光峰值，用峰值绘制曲线，研究荧光碳点的水溶性和均一性。

1.4 生物荧光传感器的制备及检测方法

用紫外可见分光光度计测量蛋白的浓度，用PBS缓冲溶液配制Gαa蛋白浓度为2.0mg/mL，用量6mL，加入5μL的EDC，在37℃下反应30min，活化蛋白中的-COOH。用超滤离心管离心，将多余的EDC除去，然后加入2mL的碳点（-NH4修饰），37℃下反应3h，制备成检测真菌感染时（1，3）-β-D葡聚糖含量的生物荧光传感器。

检测原理是，利用碳点上带有的-NH4与Gαa蛋白中-COOH发生脱水缩合反应，即将Gαa蛋白连在碳点上；加入待检测物（1，3）-β-D葡聚糖，βG可与Gαa蛋白特异性氨基酸序列结合，从而进一步增加碳点的的体积；而碳点的荧光强度会随着待测物浓度的上升而出现荧光峰值上升的现象。通过分析荧光峰值上升程度与βG浓度之间关系，可以获得βG检测标准曲线，进而可以检测溶液中的Gαa蛋白浓度。

为了保证碳点荧光的稳定性，研究在不同温度、反应时间、pH值和在25mM Mg2+用量条件下对反应的影响，根据反应曲线最终确定最佳反应条件。

在96孔黑板中加入200μL生物荧光传感器和30μL用蒸馏水梯度稀释的（1，3）-β-D葡聚糖标准品，加入6μL Mg2+，在温度37℃下反应10min，放入荧光酶标仪中，输入最佳激发波长和检测参数，检测荧光强度。设定含有（1，3）-β-D葡聚糖的样品荧光光强与空白对照荧光光强之差为传感器响应值（荧光值），绘制标准曲线。

1.5 方法学评估

对所建立的方法进行了批间、批内精密度实验、准确度（回收率）实验和稳定性实验。

2 实验结果

2.1 重组目的菌的表达及纯化

对重组工程菌采用IPTG诱导，使其表达Gαa蛋白，过Ni柱纯化蛋白，向Ni柱中依次加入，BL21-pET-15b-Gαa总蛋白、NPI-1、NPI-20（PBS，含有咪唑 20mmol/L，pH 7.4）、NPI-30（PBS，含有咪唑 30mmol/L，pH 7.4）和 NPI-200（PBS，含有咪唑200mmol/L，pH 7.4），收集流出样，经过SDS-PAGE鉴定，结果如蛋白电泳图1所示，6号条带为纯化后的Gαa蛋白，纯化产物在约40kDa处有一条明显表达带，与预期蛋白分子量相符，Gene Tools软件分析结果显示纯化后Gαa蛋白含量达到85%。

图1 Gαa蛋白诱导表达及纯化SDS-PAGE电泳

2.2 碳点表征

用透射电镜扫描碳点，结果如图2所示，得到其大小在1nm-10nm之间，符合正态分布，碳点的大小居中在5nm。说明该氨基修饰碳点均一性较好，可用于后续试验。

图2 TEM对碳点的表征

2.3 碳点的荧光强度曲线

用荧光分光光度计检测碳点在不同激发波长340nm～400nm下的荧光光谱变化，最终找到最佳的激光波段，如图3所示，在360nm波长的激发下，荧光发射光强在430nm时可达到最高值。当激发波长发生变化时，碳点的荧光光谱出现了红移或是蓝移现象，荧光峰值也随之变化。

图3 在不同波长激发下的荧光光谱

2.4 碳点的溶解性和均一性

将碳点用蒸馏水进行5次稀释，稀释比例分别为1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32。对溶液进行紫外光照射，观察溶液发射的荧光光强变化，如图4左上方所示，碳点在紫外光下照射发出蓝色的荧光，荧光光强随着碳点的梯度稀释而减弱。

用荧光分光光度计，检测不同浓度的碳点，在检测仪器中输入最佳激发波长360nm，检测荧光光强的峰值并绘制曲线。如图4所示，X轴为碳点的相对浓度，Y轴为最高荧光强度值，曲线R2=0.999，说明碳点的水溶性和均一性良好。

图4 不同浓度碳点的荧光强度变化

2.5 实验原理图

碳点-Gαa蛋白荧光生物传感器检测（1，3）-β-D葡聚糖原理如图5所示，氨基修饰碳点与Gαa蛋白羧基进行脱水缩合反应，合成荧光生物传感器，该传感器上的蛋白质可与待检测样品中βG特异性结合，待反应结束后荧光传感器在激发光波长为360nm处进行激发，检测发射光荧光光谱。结果显示在470nm处出现峰值，且随着βG浓度增加，荧光光谱峰值也随之增加。

图5 实验原理

2.6 反应条件的摸索

图6 反应条件的研究

对不同温度、pH值、反应时间、和25mM Mg2+的用量对实验反应数据的影响进行了实验摸索。结果如图6所示，图6（a）为对反应温度的摸索，当温度从10℃增加到60℃时，可知37℃为最佳反应温度；图6（b）为对溶液pH的摸索，溶液pH值在4～9的反应体系时，可知偏中性pH=6.8为最佳反应pH；图6（c）为对反应时间的摸索，当时间从0min增加到60min时，从图可知10min为最佳反应时间；图6（d）为25mM Mg2+的用量摸索，当用量从0μL增加到12μL时，从图可知6μL为最佳反应用量。

2.7 （1，3）-β-D葡聚糖标准荧光曲线

在黑色的酶标板中加入200μL生物荧光传感器和30μL用蒸馏水稀释的βG，加入6μL的25mM Mg2+，在温度37℃下反应10min，用荧光酶标仪在360nm激发，470nm检测溶液发射的荧光光强。将测得的荧光值绘制成标准曲线，结果如图7所示，X轴为βG浓度，Y轴为实测荧光值减去空白荧光值，线性范围是9.375-150pg/mL。对βG标准品进行梯度稀释进行检测，测得最低检测限为9.375pg/mL。

图7 不同浓度的βG在生物荧光传感器中的荧光强度

2.8 方法学的评估

做5组平行实验，对所建立的方法进行了批间、批内精密度、准确度（回收率）和稳定性测定。结果如表1所示，批间和批内的变异系数均小于5%，准确度（回收率）在97%～102%之间，在7天内，生物荧光传感器保持稳定。

表1 实验方法学的评估

3 结论

本文表达了与（1，3）-β-D葡聚糖特异性结合的美洲鲎G因子α亚基片段a（Gαa）蛋白，蛋白质量为40kDa，浓度为2mg/mL。氨基化修饰碳点平均直径5nm，具有良好的水溶性和均一性。文中采用EDC/NHS氨基与羧基脱水缩合反应，将Gαa蛋白与碳点偶联，构建了定量检测（1，3）-β-D葡聚糖的生物荧光传感器，并对该荧光检测方法进行优化，荧光强度与（1，3）-β-D葡聚糖浓度呈正线性相关，检测标准曲线y=10.697x+148.52，R2=0.993，检测下限9.375pg/mL。该方法批间和批内变异系数CV均小于5%，准确度（回收率）在97%～102%之间。

市售βG测定试剂盒均采用天然鲎血作为检测试剂，鲎属于二级保护动物，因此该方法不仅成本高，而且易出现资源枯竭，长期将对生态环境的稳定造成破坏。本文原核表达了（1，3）-β-D葡聚糖特异性结合美洲鲎G因子α亚基片段a（Gαa）蛋白，与氨基化碳点偶联，建立了荧光传感检测方法，能够实现（1，3）-β-D葡聚糖的定量检测，无需采集天然珍惜鲎血作为试剂，在降低检测成本的同时，保护了野生生物资源。采用酶标板可以实现高通量96个样本的检测，节约大量人力物力。本方法对（1，3）-β-D葡聚糖的检测下限为9.375pg/mL，优于市售（1，3）-β-D葡聚糖测定试剂盒的11pg/mL，达到国家标准。因此，建立的生物荧光传感器定量检测（1，3）-β-D葡聚糖的方法具有高灵敏、高特异性、快速、高通量、低成本的特点，具有广泛的应用价值。

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A High Selective and Specific Fluorescent Test Method for The Detection of（1，3）-β-D-Glucan

GE Yuxin1，ZHANG Yang2，TIAN Zhenhua2，YU Yuanhua2，GUO Rui2，ZHANG Hao2
（1.Hospital of Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022；2.School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）

The concentration of（1，3）-beta-D glucan（βG）in human serum is a clinical testing index of invasive fungal infection，a beta-glucan binding protein of horseshoe crab（limulus polyphemus）factor G-subunit α fragment-a（Gαa）was expressed in Escherichia coli BL21，Coupling of amination retouching carbon dots with G protein and establishing a“carbon dots/Gαa protein”fluorescent sensor for βG detection.The sensor excitation wavelength was 360 nm，emission wavelength was 460nm.The fluorescent and the concentration of βG were a positive linear correlation.，the detection range was 9.375～150pg/mL，the limit of detection was 9.375 pg/mL.The CV values within batch and between batches were all less than 5%，accuracy（recovery） were between 97%～102%.The novel fluorescent sensor for the detection of βG was low cost，rapid，high selective，sensitivity and specificity.

（1，3）-β-D-glucan；Gαa protein；carbon dots；fungus.

O613.71

A

1672-9870（2017）04-0133-05

2017-04-17

吉林省科技厅资助项目（20140309013YY）

葛宇新（1971-），女，本科，主管护士，E-mail：837349751@qq.com