云南省马铃薯晚疫病菌对氟吗啉的敏感性测定

曹继芬，孙道旺，张永妹，杨明英，赵志坚 *

(1.云南省农业科学院农业环境资源研究所，云南 昆明 650205；2.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南 昆明 650223；3.迪庆州农业科学研究所，云南 香格里拉 674400)

云南省马铃薯晚疫病菌对氟吗啉的敏感性测定

曹继芬1，孙道旺2，张永妹3，杨明英1，赵志坚1 *

(1.云南省农业科学院农业环境资源研究所，云南 昆明 650205；2.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南 昆明 650223；3.迪庆州农业科学研究所，云南 香格里拉 674400)

采用含药平板法测定了分离自云南省马铃薯产区昭通、曲靖、大理、昆明和玉溪等地的晚疫病菌对新型杀菌剂氟吗啉的敏感性。结果表明：氟吗啉对云南省晚疫病菌的抑菌活性较高，50个菌株均为氟吗啉敏感菌株，EC50值分布于0.0743～0.2934 μg/mL，平均EC50值为(0.1638±0.0420)μg/mL，最不敏感菌株是最敏感菌株的3.95倍。分离自昭通的晚疫病菌菌株对氟吗啉最敏感，曲靖和大理的菌株次之，昆明和玉溪的菌株敏感性最低，但各地晚疫病菌对氟吗啉的EC50值无显著性差异。测定的马铃薯晚疫病菌对氟吗啉的敏感性频率分布呈连续的单峰曲线，可将平均EC50值(0.1638±0.0420)μg/mL作为云南省马铃薯晚疫病菌对氟吗啉的敏感基线。氟吗啉与甲霜灵之间无交互抗性，氟吗啉可作为防控晚疫病的高效药剂。

晚疫病菌；氟吗啉；敏感基线；马铃薯

由致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的晚疫病是制约马铃薯产业健康发展的瓶颈因素之一，主要防治措施除种植抗病品种外，目前最重要的就是化学药剂防治。在铜制剂和代森锰锌等保护性杀菌剂被使用之后，以甲霜灵和霜脲氰为代表的苯基酰胺类和乙酰胺类内吸性杀菌剂被广泛用于晚疫病的防治[1]，然而，目前在中国各省份的马铃薯和番茄产区已检测到较高频率的甲霜灵抗性菌株[2-5]，表明中国晚疫病菌群体对甲霜灵产生了抗药性。近年来，由于羧酸酰胺类(Carboxylic acid amides, CAAs)杀菌剂对植物卵菌病害具有优异的保护和治疗作用，且与甲霜灵等苯酰胺类杀菌剂之间无交互抗药氟吗啉(flumorph)是沈阳化工研究院创制开发的拥有自主知识产权的羧酸酰胺类新型内吸性杀菌剂，具有优异的保护活性、治疗活性和抑制疫霉菌孢子萌发活性、持效期长、对作物安全等特点[7]。随着氟吗啉及烯酰吗啉等其它同类杀菌剂的广泛使用，抗药性风险问题逐渐引起人们的关注。目前辣椒疫霉、瓜果疫霉、致病疫霉、霜霉菌等卵菌对烯酰吗啉、氟吗啉等羧酸酰胺类杀菌剂的抗药性研究已有相关报道[9-12]。云南是中国最具代表性的西南马铃薯混作区，马铃薯种植区域广、周年生产，种植面积达到了48.58万hm2[13]。由于在马铃薯生育期适逢低温高湿的气候条件，全省马铃薯产区晚疫病常年发生、流行，危害严重。在生产中，氟吗啉近年来已被用于云南马铃薯晚疫病的防治，但不同地理分布的病原菌群体对氟吗啉的抗药性水平尚不清楚。本研究拟通过云南不同地理来源的马铃薯晚疫病菌对氟吗啉的敏感性进行测定，建立敏感基线，以期为云南马铃薯晚疫病菌的抗药性监测以及病害的科学防治提供理论依据。

表1 供试晚疫病菌菌株来源及对甲霜灵的敏感性

性而受到了广泛重视，逐渐成为替代苯基酰胺类杀菌剂的一类重要的新型防治农药[6]。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试马铃薯晚疫病菌菌株50个，其中甲霜灵中抗菌株12个，抗性菌株38个(表1)。2010-2011年分离自云南大春马铃薯主产区昭通、曲靖和大理，反季马铃薯产区昆明和玉溪，所有病原菌由作物疫病实验室保存。

1.2 供试药剂

供试95 %氟吗啉(flumorph)原药，由沈阳化工研究院提供。用分析天平称取适量氟吗啉原药，溶于二甲基亚砜(Sigma, D5879)，配制成10 mg/mL贮液，置于4 ℃冰箱中备用。

1.3 供试培养基

黑麦培养基用于供试菌株的培养、氟吗啉敏感性测定，制备方法参照Caten等的方法[13]。

1.4 氟吗啉敏感性测定

采用含药平板法测定氟吗啉敏感性[1]。供试菌株在黑麦培养基上18 ℃黑暗培养7～10 d后，分别配制含氟吗啉0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6和1.0 μg/mL 8个不同浓度梯度的黑麦培养基平板。用直径为5 mm的打孔器在相同圆周的菌落边缘上切取菌饼，将菌饼正面朝下，分别接种到含氟吗啉系列浓度的平板上，每处理3次重复，置于18 ℃恒温培养箱中黑暗培养5 d后，用十字交叉法测量菌落生长直径。根据菌落直径计算出生长量，计算氟吗啉各浓度梯度对晚疫病菌菌丝生长抑制率，计算公式如下。

抑制率(%)=

1.5 数据分析

采用Microsoft Office Excel 2003软件处理整理数据，用DPS数据处理软件将试验药剂浓度转化成对数(X)、抑制率转换成几率值(Y)，根据X与Y的线性关系求出毒力回归方程Y=A+BX、根据X与Y的线性关系计算出相关系数(r)、氟吗啉抑制菌丝生长50 %的有效质量浓度(EC50值)，最后根据敏感群体的EC50值分布建立马铃薯晚疫病菌对氟吗啉的敏感基线。

2 结果与分析

2.1 不同地理来源的马铃薯晚疫病菌对氟吗啉敏感性测定

昭通、曲靖、大理、昆明和玉溪等5个不同地理来源的马铃薯晚疫病菌菌株对氟吗啉的敏感性如表2和图1。各个马铃薯产区的晚疫病菌对氟吗啉的敏感性与地理分布没有明显的相关性，来自同一个马铃薯产区的晚疫病菌菌株对氟吗啉的敏感性有一定程度上的差异。相对而言，分离自昭通的马铃薯晚疫病菌株对氟吗啉最敏感，EC50范围为0.0836～0.1941 μg/mL，平均值为(0.1442±0.0291)μg/mL，其次是曲靖和大理两地的马铃薯晚疫病菌株，EC50平均值分别为(0.1637±0.0346)和(0.1605±0.0214)μg/mL，而昆明和玉溪两地的马铃薯晚疫病菌株对氟吗啉的敏感性稍有下降，EC50平均值分别为(0.1824±0.0577)和(0.1759±0.0574)μg/mL。测定结果显示：来自5个不同马铃薯产区的50个晚疫病菌中没有发现对氟吗啉有抗性的菌株，均为敏感菌株，且EC50值均小于0.3 μg/mL，表明氟吗啉对云南省马铃薯晚疫病菌的抑制活性较高。经Duncan新复极差法比较，5个不同马铃薯产区的晚疫病菌对氟吗啉的EC50值差别无显著性意义。

表2 云南省马铃薯晚疫病菌对氟吗啉的敏感性

注：表中 “a”表示5 %显著水平。

Note: The‘a’ indicates a significant level of 5 %.

2.2 云南马铃薯晚疫病菌对氟吗啉的敏感基线

分离自云南省昭通、曲靖、昆明、大理和玉溪等5个马铃薯产区的晚疫病菌对氟吗啉的敏感性结果显示：50个菌株对氟吗啉的EC50值分布于0.0743～0.2934 μg/mL，最不敏感菌株是最敏感菌株的3.95倍，平均EC50值为(0.1638±0.0420)μg/mL。测定的50个马铃薯晚疫病菌株对氟吗啉的敏感性频率分布呈连续的单峰曲线(图2)，可将平均EC50值(0.1638±0.0420)μg/mL作为云南省马铃薯晚疫病菌对氟吗啉的敏感基线，对田间晚疫病菌群体的抗药性水平进行监测。

图1 云南不同马铃薯产区晚疫病菌对氟吗啉的EC50平均值Fig.1 The EC50 average value of Phytophthora infestans to flumorph of different potato producting areas in Yunnan

2.3 氟吗啉与甲霜灵无交互抗性

分析供试的马铃薯晚疫病菌12个甲霜灵中抗菌株和38个抗性菌株对应的氟吗啉敏感性发现，甲霜灵中抗菌株对氟吗啉的EC50值范围在0.1163～0.2155 μg/mL，抗性菌株对氟吗啉的EC50值范围在0.0836～0.2934 μg/mL。氟吗啉对甲霜灵中抗和抗性菌株均表现出较高的抑制活性，表明晚疫病菌对甲霜灵的抗药性水平与对氟吗啉的抗药性水平无相关性，甲霜灵中抗和抗性菌株并没有表现出对氟吗啉亦有较高的抗性水平，证明羧酸酰胺类(氟吗啉)与苯基酰胺类(甲霜灵)杀菌剂之间无交互抗性。

3 讨 论

从人类历史上著名的“爱尔兰饥馑”至今，马铃薯晚疫病仍旧在世界各地的马铃薯产区危害流行，造成巨大的经济损失和社会影响。由于病原菌进化快、易发生变异，致病性强[15]，导致马铃薯抗病育种难度大，在生产上可供利用的抗性品种非常匮乏，目前对晚疫病的防治主要依赖于化学杀菌剂。20世纪80年代以来，随着马铃薯晚疫病菌等植物病原卵菌对苯酰胺类杀菌剂抗药性的普遍发生，对卵菌病害的防治提出了新的挑战。羧酸酰胺类(CAAs)杀菌剂是目前生产上替代苯酰胺类杀菌剂的主要防治药剂[6]。

图2 马铃薯晚疫病菌对氟吗啉EC50值的频率分布Fig.2 Frequency distribution of the EC50 value of field isolates of Phytophthora infestans against flumorph

随着CAA类杀菌剂广泛在植物卵菌病害防治中的应用，各国对该类杀菌剂的作用机制和抗药性风险进行了诸多研究。如在离体条件下，氟吗啉对大豆疫霉菌4个发育阶段均有显著的抑制作用，对菌丝生长的EC50值为0.1906 μg/mL，在0.5 μg/mL浓度下对大豆疫霉菌孢子囊形成和孢子萌发抑制率达100 %，效果好于甲霜灵[16]。辣椒疫霉菌和黄瓜疫霉菌对氟吗啉具有中等抗药性风险[17-18]，而黄瓜霜霉菌对氟吗啉则具有较高的抗药性风险[12]。Yuan等报道了中国内蒙古和黑龙江马铃薯晚疫病菌对氟吗啉的敏感性测定，结果显示两省区的晚疫病菌对氟吗啉有相似的敏感性水平，EC50值范围为 0.1016～0.3228 μg /mL，平均(0.1813± 0.0405)μg /mL[11]。本研究测定了50个云南马铃薯晚疫病菌菌株，氟吗啉对所有菌株的抑制活性较高，EC50值范围为0.0743～0.2934 μg/mL，平均EC50值(0.1638±0.0420)μg/mL，均为敏感菌株，与内蒙古和黑龙江晚疫病菌的平均EC50值相比，云南的菌株对氟吗啉更敏感，表明云南马铃薯主产区晚疫病菌对氟吗啉的抗药性水平更低，可作为晚疫病田间防治的理想药剂。通过云南晚疫病菌甲霜灵中抗和抗性菌株对氟吗啉的敏感性分析，表明晚疫病菌对甲霜灵的抗药性水平与对氟吗啉的抗药性水平无相关性，证明了氟吗啉与甲霜灵之间无交互抗药性。需要注意的是，尽管目前氟吗啉对于缓解和治理植物卵菌病原菌对苯酰胺类杀菌剂的抗药性问题起到了重要的作用，但要延缓病原菌对该杀菌剂抗性的产生，应与其它无交互抗性的杀菌剂轮换使用[19]，并尽量减少药剂的施用量和使用次数，以合理延长每种防治药剂在生产上的使用年限。

本研究测定的马铃薯晚疫病菌主要来源于大春马铃薯主产区昭通、曲靖和大理，以及反季马铃薯产区昆明和玉溪，能较好地反映出云南马铃薯产区晚疫病菌的地理分布情况。2010-2011年收集的不同地理来源的马铃薯晚疫病对氟吗啉的敏感性水平虽然不尽相同，但无显著差异，均为敏感菌株。随着氟吗啉在云南马铃薯产区的推广应用，需加强对各产区晚疫病病原菌群体的抗药性动态监测，促进晚疫病的科学防治及抗性治理策略的制定。本研究测定的EC50值(0.1638±0.0420)μg/mL可作为云南省马铃薯晚疫病菌对氟吗啉抗药性监测的敏感基线。

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(责任编辑 王家银)

SensitivityDeterminationofPotatoLateBlightDiseasePathogenPhytophthorainfestanstoFlumorphinYunnan

CAO JI-fen1, SUN Dao-wang2, ZHANG Yong-mei3, YANG Ming-ying1, ZHAO Zhi-jian1 *

(1.Agricultural Environment & Resources Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Kunming 650205, China; 2.Biotechnology and Germplasm Resources Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Kunming 650223, China; 3.Diqing Institute of Agricultural Sciences, Yunnan Shangri-La 674400, China)

The sensitivity of fifty isolates ofPhytophthorainfestanscollected from potato production area Zhaotong, Qujing, Dali, Kunming and Yuxi in Yunnan province against new fungicide flumorph was assayed by fungicide-amended plates. The results showed that flumorph had high inhibition activity to all isolates ofP.infestans. All fiftyP.infestanisolates were sensitive, and the EC50value ranged from 0.0743 μg/mL to 0.2934 μg/mL, and the EC50average value was(0.1638±0.0420)μg/mL. The EC50value of the most insensitive isolate was 3.95 times to that of the most sensitive one.P.infestansisolated from Zhaotong were the most sensitive to flumorph, followed by isolates from Qujing and Dali, and the isolates from Kunming and Yuxi were lower sensitivity. However, the EC50value of all isolates from different geographical regions to flumorph had no statistical difference. The sensitivity frequency of fifty isolates to flumorph had a unimodal curve distribution, so the EC50average value(0.1638±0.0420)μg/mL could be used as baseline sensitivity ofP.infestansto flumorph in Yunnan province. The result also showed that there was no cross resistance between flumorph and metalaxyl. Flumorph could be used as a high effective agent to control late blight disease.

Phytophthorainfestans；Flumorph；Baseline sensitivity；Potato

1001-4829(2017)3-0580-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.3.017

S532

A

2015-12-28

国家自然科学基金(30960216)；云南省自然科学基金重点项目(2011FA020)；公益性行业(农业)科研专项(201303018)

曹继芬(1971-)，女，副研究员，主要从事植物真菌、卵菌病害研究，E-mail：cjf016@sina.com，*为通讯作者：E-mail：zhijianzhao@hotmail.com。