糯米甜酒曲根霉的筛选及强化曲的研究

魏浩林，周金虎，刘凤春，管 健，邓其锦，陈茂彬，方尚玲*

（1.湖北工业大学 生物工程与食品学院发酵工程教育部重点实验室，湖北 武汉 430068；2.湖北楚园春酒业有限公司，湖北 宜昌 444200；3.工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068；4.工业微生物湖北省重点实验室，湖北 武汉 430068）

糯米甜酒曲根霉的筛选及强化曲的研究

魏浩林1，3，4，周金虎1，3，4，刘凤春2，管 健1，3，4，邓其锦1，3，4，陈茂彬1，3，4，方尚玲1，3，4*

（1.湖北工业大学 生物工程与食品学院发酵工程教育部重点实验室，湖北 武汉 430068；2.湖北楚园春酒业有限公司，湖北 宜昌 444200；3.工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068；4.工业微生物湖北省重点实验室，湖北 武汉 430068）

选取5种不同地域、较为畅销的市售糯米甜酒曲，以酒曲酶活力为评价指标，筛选出优良糯米甜酒曲。将优良酒曲中霉菌进行分离纯化，制作纯种根霉曲，与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）不同比例混合复配制作强化曲。通过强化曲与市售酒曲的酒曲酶活力对比，并结合试制糯米甜酒的总糖、总酸、总酯、酒精度对比验证。结果表明，强化曲的最佳复配比例为：接种量为1%（其中根霉M9曲添加量0.90%，酿酒酵母添加量0.10%）。与市售甜酒曲相比，强化曲糖化力达796.5 U/g，提高14.8%；液化力达694.2 U/g，提高20.7%；试制糯米甜酒的总酯达0.78 g/L，提高168.9%；酒精度达12.1%vol，提高92.1%。经感官评价，强化曲酿制糯米甜酒口感醇甜、风味突出，感官评分为96分。

糯米甜酒曲；筛选；霉菌；强化曲

甜酒是我国传统的发酵类食品之一，因其酸甜可口、香味舒适，具备一定保健功效而深受大众喜爱[1]。市场上有很多甜酒曲酿制的甜酒，但是其发酵菌株多为纯种根霉，酒精产率及混合酸、酯类化合物生成量较低，因此甜酒生产往往面临着风味不足、酒味寡淡等一系列问题[2-3]。近年来，国内外学者对微生物发酵产物调控及强化曲的研究较为丰富。如DUNG N T P等[4]发现多种酵母与霉菌复配发酵米酒可产生独特香味成分；况启生等[5]用不同菌种混合制曲生产多种风味的米酒；张新武等[6]从客家糯米酒药曲中分离出两株根霉和酵母，通过复配开发强化曲。

所谓“好曲酿好酒”，甜酒曲的质量好坏取决于甜酒曲菌种的性能，甜酒曲菌的组成是决定甜酒好坏的核心因素[7]。酒曲中霉菌分泌的酶（淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等）可以加速将谷物中的淀粉、蛋白质等转变成糖、氨基酸。糖分在酵母菌的酶的作用下，进一步分解成乙醇[8-10]。因此筛选优良菌种，进一步制备强化曲具有重要的理论和实践意义。本研究选择不同地区具代表性的市售酒曲，分离筛选出酶活力高的根霉菌，制备纯种根霉曲，与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）不同比例复配，结合酶活及试制糯米甜酒理化指标对比分析确认最佳配比，制备具有高糖化力、发酵力的强化曲，以期为强化曲的开发与应用提供必要的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

糯米：武汉市武泰闸农贸市场。

酿酒高活性干酵母（Saccharomyces cerevisiae）：宜昌市安琪酵母有限公司。

酒曲：安琪风味甜酒曲、富阳甜酒曲、苏州蜜蜂甜酒药、上海太白曲、孝感风窝曲，分别编号为Ⅰ、II、Ⅲ、IV、V。

1.1.2 培养基与主要试剂

孟加拉红培养基：广东环凯微生物科技有限公司。

马铃薯琼脂（potato dextrose agar，PDA）固体培养基：土豆200g，琼脂20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20 min。

酵母浸出粉葡萄糖（yeastextractpeptone，YPD）液体培养基：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃灭菌20 min。

硫酸铜、酒石酸钾钠、氢氧化钠、冰醋酸、醋酸钠、可溶性淀粉、亚甲基蓝、碘化钾等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器及设备

ZHJH-C1212B超净工作台、ZHWY-2102C恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；CX31正置生物显微镜：日本Olympus有限公司；LDZX-75KB高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂；AP-01P抽滤机：杭州赛析科技有限公司；HK-04A粉碎机：广州市旭朗机械设备有限公司；分样筛（40目、60目）：浙江上虞市五四纱筛厂；DK-98-11电炉：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 市售酒曲酶活力测定方法

将市售酒曲研磨粉碎，过40目筛，供测定用。糖化酶活力及液化酶活力的测定：参照国标GB1886.174—2016《食品添加剂食品工业用酶制剂》中的方法；蛋白酶活力的测定：参照国标GB/T23527—2009《蛋白酶制剂》。

1.3.2 酒曲中根霉的分离与纯化

选取酶活力最高的市售甜酒曲[11-12]，从中分离根霉作为生产菌株。在无菌条件下，将酒曲粉碎，称取0.5 g样品加入无菌水中摇匀，等梯度稀释104倍，用涂布平板法涂于马丁孟加拉红平板上，28℃培养24 h。从平板中选择典型的霉菌菌落，用接种环挑取一小块菌丝移植于另一平板培养基上。经过3～4次分离纯化得到根霉，对菌落形态进行记录。将分离的根霉转接到PDA斜面上28℃培养36 h，待长好后置于4℃冰箱中保存待用。

1.3.3 纯种甜酒曲的制备

在无菌条件下，用接种环从冰箱保存的根霉斜面挑取1～2环，接入50mL的YPD培养基中，28℃、100r/min恒温摇床振摇24 h制备孢子悬液。将糯米洗净沥干，粉碎过60目筛，纱布包好干蒸20～25 min，冷去后打散分装于500 mL三角瓶中，在108℃高压灭菌20 min。将三角瓶置于无菌室中冷却至室温，每100g米粉接种1.0mL准备好的孢子悬液，置于30℃恒温培养箱中进行培养24 h，待观察到三角瓶内部分菌丝倒伏时，间歇12h进行一次扣瓶，继续培养至48 h，用牛皮纸包裹37℃通风干燥24 h，粉碎过40目筛，即得到纯种根霉曲。

1.3.4 强化酒曲的制作

制曲过程中适当的接种量有利于菌体的生长、培养基营养成分的合理利用及酶的产生。同时双菌种混合制曲过程中，根霉与酵母的比例直接影响酒曲糖化力与发酵力的平衡。参考张新武等[6]相关酒曲接种量的工艺参数，按接种量1%（根霉∶酿酒酵母=0.70∶0.30～0.95∶0.05）配比，强化酒曲制作工艺如下：

操作要点：

干炒：将洗净的糯米进行小火翻炒，炒至米色偏黄、烫手为宜；

粉碎：将炒熟糯米放入清洗干净、干燥的粉碎机中粉碎，过40目筛；

拌匀：按总量1%接入纯种根霉曲与酿酒酵母（接种比例为0.70∶0.30～0.95∶0.05），加入40%的无菌水中溶解后，拌入米粉中混合均匀；

制丸：将混合均匀的米浆捏成丸子，丸子不能太大，每100 g大概捏15～20个丸子；

发汗：将丸子放入干净的曲盒中，盖上一层纱布，在28℃恒温培养4～6 d；

烘干：将培养好的酒曲放入38℃干燥箱中烘干至水分含量＜15%。

1.3.5 糯米甜酒工艺流程及操作要点

操作要点：

浸泡：选取颗粒饱满、无发黄、无霉变、无虫害的糯米，洗净，放入陶缸中加糯米质量2.5～3.0倍的水浸泡9～12 h；

蒸饭：在108℃条件下蒸米饭20～25 min，蒸好的米饭外硬内软，疏松不烂，无白心，均匀一致；

淋冷：糯米蒸熟后立即用冷水浇淋，至30～35℃即可；

拌曲：等待米饭摊凉后，将1%酒曲和米饭搅拌均匀；

糖化发酵：将米饭置于28～32℃恒温发酵，在20～30 h出现糖化液时按米饭质量1∶1加水，继续发酵3～4 d；

过滤：将发酵好的米饭先经过四层纱布过滤，再经抽滤机抽滤。

巴氏灭菌：将过滤后的米酒清汁放入65℃水浴锅加热25～30min，待冷却后放入4℃冰箱保藏待用，即为成品酒。1.3.6糯米甜酒指标测定

为进一步比较市售甜酒曲与强化曲的性能，将两者酿制糯米甜酒理化指标进行对比分析。糯米甜酒总糖的测定：采用国标GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》；总酸的测定：采用国标GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》；酒精度和总酯的测定：参考邸利娜等[15]的研究方法。

1.3.7 甜酒感官评定

参照吴琼燕等[16-17]对米酒评定方法，对酿制的糯米甜酒进行感官评定，请30位品评员对各酒样进行感官评价，满分100分。糯米甜酒感官评分标准见表1。

表1 糯米甜酒感官评分标准Table 1 Standards of sensory evaluation of glutinous rice wine

2 结果与分析

2.1 市售酒曲的比较

对5种酒曲的糖化力、液化力及蛋白酶活力进行测定，结果如表2所示。

表2 不同酒曲发酵性能的比较Table 2 Comparison of fermentation performance of differentJiuqu

由表2可知，II号酒曲糖化力、液化力、蛋白酶活力均高于其他酒曲。DUNG N T P等[18]报道了关于越南米酒霉菌与酵母的功能研究，表明糯米甜酒还原糖的含量与霉菌的降解淀粉能力密不可分。因此可判断，II号酒曲含优良降解淀粉、生成还原糖的霉菌，并且性能稳定，将其分离纯化，可作为高糖化力纯种根霉曲使用。

2.2 根霉的分离纯化

在孟加拉红培养基上经过多次分离纯化，从II号酒曲中筛选出一株根霉，编号为M9。对菌株M9进行形态观察，结果见图1。由图1A可知，菌株M9菌落疏松，菌丝细弱，产生孢子少且颜色较浅，菌丝生长迅速。菌株M9应用于甜酒曲制作过程中能使菌体短时间内大量增殖，避免酒曲变黑变黄，是制备甜酒曲的优质生产菌株的前提条件。由图1B可知，菌株M9菌丝无隔膜、有分支，匍匐枝的节间形成特有的假根，从假根处丛生直立的孢子梗，孢子囊成球形或近球形，从形态学角度初步判断菌株M9为根霉菌。

图1 菌株M9的菌落特征（A）和菌株形态（B）Fig.1 Colony characteristics(A)and cell morphology(B)of strain M9

2.3 强化曲复配试验

对不同复配比例的强化曲进行酶活测定，其结果见表3。

表3 不同复配比例对强化曲发酵性能的影响Table 3 Effect of different compound proportion on fermentation performance of fortified Qu

由表3可知，适当添加酿酒酵母，强化曲酶活力有所提高。当纯种根霉曲∶酿酒酵母=0.90∶0.10时，强化曲酶活力均达到最大，糖化力达796.5 U/g，较II号酒曲提高14.8%；液化力达694.2 U/g，较II号酒曲提高20.7%。而随着酿酒酵母添加比例的继续加大，霉菌的生长受到了抑制，酒曲糖化力、液化力直线下降。

2.4 试制糯米甜酒的对比验证

2.4.1 试制糯米甜酒理化指标比较

参考1.3.4糯米甜酒酿制工艺，通过比较②号强化曲与5种市售曲试制糯米甜酒的总糖、总酸、总酯及酒精度，进一步对比强化曲与市售曲的发酵性能，结果如表4所示。

表4 不同酒曲对糯米甜酒品质的影响Table 4 Effect of differentJiuquon quality of glutinous rice wine

由表4试制糯米甜酒理化指标对比，②号强化曲试制糯米甜酒总糖137.5 g/L，总酸5.2 g/L，酸甜适中。总酯达0.78g/L，同比II号提高168.9%，酒精度达12.1%vol，同比II号提高92.1%。这说明在接种量为1%（根霉M9曲0.90%，安琪酿酒酵母0.10%）时，酒曲糖化力、液化力不仅能保持在较高水平，而且试制糯米甜酒出酒率及酯类化合物的生成对比市售酒曲有了显著的提升。

2.4.2 试制糯米甜酒的感官评价比较

对5种市售糯米甜酒曲和②号强化曲试制的糯米甜酒进行感官评价，结果见表5。

表5 糯米甜酒的感官评价结果Table 5 Sensory evaluation results of glutinous rice wine

由表5可知，综合品评分数最高是②号强化曲试制的糯米甜酒，为96分。表明②号曲不仅保持了较高的糖化力，而且与适当比例酿酒酵母复配后亦有较高的发酵力，因此酿制甜酒香甜可口，风味十足，酒体丰满协调。

3 结论

通过对市售酒曲酶活力的比较筛选出优良市售曲—“富阳甜酒曲”，将富阳甜酒曲中的根霉进行分离提纯，酿酒酵母，对强化曲进行发酵试验，对所制糯米甜酒进行理化指标检测和感官评价。结果表明，以糯米为制曲原料，接种量为1%（其中根霉M9曲0.90%，酿酒酵母0.10%），强化曲糖化力达796.5 U/g，液化力达694.2 U/g，蛋白酶活力达752.8 U/g。试制糯米甜酒测定总酯达0.78 g/L，同比富阳甜酒曲提高168.9%，酒精度达12.1%vol，同比富阳甜酒曲提高92.1%。本研究提高酒曲的发酵力和酯化力，弥补了市售酒曲产香不足、酒化力较低的特点，所酿甜酒香甜可口、闻香舒适、回味悠长，为制作新型酒曲提供新思路。

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Screening ofRhizopusfrom glutinous rice wine starter and research on fortified Qu

WEI Haolin1,3,4,ZHOU Jinhu1,3,4,LIU Fengchun2,GUAN Jian1,3,4,DENG Qijin1,3,4,CHEN Maobin1,3,4,FANG Shangling1,3,4*
(1.Key Laboratory of Fermentation Engineering of Ministry of Education,College of Bioengineering and Food,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China;2.Hubei Chuyuanchun Winery Co.,Ltd.,Yichang 444200,China;3.Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation,Wuhan 430068,China;4.Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology,Wuhan 430068,China)

Choosing five kinds of popular commercial glutinous rice wine starter from different regions,usingJiuquenzyme activity as evaluation index,the excellent glutinous rice wine starter was screened.The mold in the glutinous rice wine starter was isolated and purified,pureRhizopusQu was made and then was mixed with different proportion ofSaccharomyces cerevisiaeto make fortified Qu.Through the comparison of theJiuqu enzymes activity of the fortified Qu and commercial Daqu,and the contents of total sugar,total acid,total ester and alcohol in glutinous rice wine fermented by the Daqu were detected.The results showed that the optimum complex proportion of fortified Qu:inoculum 1%(includingRhizopusM9 Qu 0.90%andS.cerevisiae0.10%).Compared with the commercial Daqu,the saccharification power and liquefaction power of the fortified Qu were 796.5 U/g and 694.2 U/g,respectively,and increased by 14.8%and 20.7%,respectively.The total ester and alcohol contents of glutinous rice wine fermented by fortified Qu were up to 0.78 g/L and 12.1%vol,respectively,which increased 168.9%and 92.1%,respectively.By sensory evaluation,the glutinous rice wine fermented by the fortified Qu had mellow and sweet taste and outstanding flavor,the sensory score was 96.

glutinous rice wine starter;screening;mold;fortified Qu

TS262.4

0254-5071（2017）09-0041-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.009

2017-03-22

“十三五”国家重点研发计划项目重点课题子课题（2016YFD0400500）

魏浩林（1996-），男，本科生，研究方向为发酵工程。

*通讯作者：方尚玲（1967-），女，教授，博士，研究方向为酿酒微生物。