烟草黑胫病抗性鉴定方法比较及其相关性分析

丁燕芳　平文丽　孙计平

摘要：為明确烟草黑胫病（Phytophthora parasitica var. nicotianae Tucker）抗性鉴定方法，采用粗毒素浸种法、粗毒素浸根法、孢子悬浮液浸根法及田间病圃接种法，研究烟草革新3号（抗病品种，R）、G28（R）、金星6007（中抗品种，MR）、小黄金1025（感病品种，S）、红花大金元（S）等对烟草黑胫病的抗性，并对其抗性鉴定效果进行相关性分析。结果表明，孢子悬浮液浸根法的鉴定结果与粗毒素浸种法的鉴定结果呈显著负相关，与田间病圃接种法的鉴定结果呈显著正相关。粗毒素浸种法不受季节限制，可以对烟草材料黑胫病的抗性进行大批量筛选。粗毒素浸根法和田间病圃接种法有一定的缺陷，可以作为粗毒素浸种法和孢子悬浮液浸根法的辅助鉴定方法。在整个抗性鉴定过程中，孢子悬浮液浸根法可观测到烟株病情指数和发病率的动态变化，较其他3种方法更能准确、合理地评价品种抗性。

关键词：烟草黑胫病（Phytophthora parasitica var. nicotianae Tucker）；抗性鉴定效果；相关性分析

中图分类号：S435.72 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）18-3477-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.18.021

Abstract： In order to determine the reasonable and effective method for the identification of resistance to tobacco black shan disease（Phytophthora parasitica var. nicotianae Tucker），using four identification methods：Toxins soaked seed soaking method， root method， spore suspension dipping root method and field disease nursery inoculation method，the tobacco resistant of flue-cured tobacco cv. Gexin 3 （resistant，R），G28 （resistant，R），Jinxing 6007 （medium resistance，MR），Xiaohuangjin 1025 （susceptible，S） and Honghuadajinyuan（susceptible，S） were researched. And its resistance identification effects for correlation analysis were conducted. The results showed that there were negatively correlation between the identification results of the immersing seeds method and the identification results of immersing root in spore suspension. There were significantly positive correlation between the identification results of the immersing root in spore suspension and the results of inoculating in disease nursery. The immersing seeds with liquid toxin was unaffected by seasonal factors， which could be used to screen tobacco varieties with black shank disease resistance in a large scale all the year round. There were somewhat defects in immersing immersing roots with liquid toxin and inoculating in disease nursery methods had flaws， which could be used to assist the methods of immersing seeds with liquid toxin and immersing root in spore suspension to evaluate disease resistance level of different tobacco varieties. Immersed the root with pore suspension could be applied to observe dynamic change of the disease index and the incidence rate of the tobacco during the whole inoculating process. Compared with other three methods， immersing the root with pore suspension could be more accurate and reasonable to evaluate disease resistance of different tobacco varieties.

Key words： tobacco black shank（Phytophthora parasitica var. nicotianae Tucker）； resistance identification effect； correlation analysisendprint

烟草黑胫病（Phytophthora parasitica var. nicotianae Tucker）是典型的土传性单循环病害，可为害烤烟、晾烟、晒烟等栽培烟草[1]，且多与青枯病混合发生[2]，对烟叶的产量和品质造成较大损害[3，4]。随着中国烟田连作面积的不断扩大，连作年限的不断增长，加重了该病害的流行。目前生产上对烟草黑胫病的防治主要有栽培防治、农业防治、生物防治等方法[5，6]。与这些防治方法相比，选育和利用抗性品种是一种更为经济有效的措施。而抗病性鉴定是选育抗性材料的关键，是烟草新品种选育过程中不可或缺的环节[7]。

烟草黑胫病接种鉴定方法有室内接种鉴定法和田间接种鉴定法。室内接种鉴定法主要包括游动孢子悬浮液灌根接种法[8]、菌丝块茎基部针刺创伤接种法[9]、菌丝块茎基部不创伤接种法[7-9]和黑胫病菌毒素浸种鉴定法[10]等。龚龙英等[10]研究指出，不同接种方法对烟草黑胫病菌致病力的测定有一定影响。为此，本研究利用粗毒素浸种法、粗毒素浸根法、孢子悬浮液浸根法及田间病圃接种法等4种方法，对5份不同抗性煙草材料（革新3号、G28、金星6007、小黄金1025和红花大金元）进行鉴定，并对不同的鉴定方法进行比较，以期找出更为有效的烟草黑胫病鉴定方法，为今后烟草黑胫病抗性鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试烟草品种为抗病品种革新3号（R）和G28（R）、中抗品种金星6007（MR）、感病品种小黄金1025（S）和红花大金元（S）[11]。用于接种鉴定的烟草黑胫病菌1号强毒菌株由中国农业科学院烟草研究所提供。

1.2 试验地点

烟草种子接种鉴定试验在河南省农业科学院烟草研究所分子实验室进行，苗期鉴定试验在河南省农业科学院烟草研究所育苗温室大棚和实验室进行，大田成株期鉴定试验在河南省农业科学院试验田黑胫病病圃内进行。

1.3 接种病原菌的制备

1.3.1 孢子悬浮液的制备 将烟草黑胫病菌接种到燕麦平板培养基上，在28 ℃下培养7 d后，挑取菌丝体接种到燕麦培养液中，置于120 r/min的摇床上培养14 d（28 ℃），制成游动孢子悬浮液。再用1%葡萄糖液配制成1×106 CFU/mL的孢子悬浮液，备用[7]。

1.3.2 粗毒素的制备 采用庞龙等[12]的方法制备烟草黑胫病菌的粗毒素。用打孔器将在燕麦平板培养基上培养7～14 d的烟草黑胫病病菌打成直径为0.5 cm的菌饼，接种到含150 mL燕麦培养液的250 mL锥形瓶中，每瓶接种6块菌饼。置于150 r/min恒温（28 ℃）摇床上，暗培养14 d，用双层纱布滤去培养液中的菌丝，取滤液8 000 r/min离心15 min制取上清液，再用0.22 μm微孔无菌滤液器过滤，得到无菌粗毒素原液，置于4 ℃备用。

1.4 方法

1.4.1 粗毒素浸种法 种子消毒：每个品种分别挑选150粒饱满的种子，用浓度为75%乙醇浸泡3 min，再用浓度为3%的次氯酸钠浸泡5 min，用无菌水清洗3次。

毒素处理：将5个品种的种子分别装入2 mL无菌离心管中（每管各装150粒），在每个离心管中加入1.5 mL浓度为1 000 μL/mL的粗毒素液[9]，浸泡8 h后取出种子，分别播种在铺有湿润滤纸的无菌培养皿中，每皿播种50粒种子，每个品种播种3皿。

5 d后调查病情，计算发病率。

1.4.2 室内粗毒素浸根法 供试烟草品种采用漂浮育苗方法育苗[7]。待烟苗长到4～5叶期时，移植到200孔的聚苯乙烯塑料泡沫漂浮苗盘中。每个苗盘移植5个不同抗性品种，每个品种选取20株，重复3次。等苗龄达到30 d，整盘苗装入室内固定育苗盒内，用粗毒素液（制备方法参照“1.3.2”）代替漂浮育苗的营养液，进行粗毒素浸根处理。5 d后调查病情，计算发病率。

1.4.3 孢子悬浮液浸根法 孢子悬浮液浸根鉴定法同“1.4.2”。每个育苗盒内的500 μL/mL粗毒素液用1×106 CFU/mL孢子悬浮液代替。接种5 d后调查病情（病株数及每病株病级），并计算发病率和病情指数[13]。

1.4.4 田间病圃接种法 选用历年黑胫病高发区连作烟田为病圃，待烟苗生长到7～8片真叶时移栽到病圃里。每小区移栽5个不同抗性品种，每个品种选取20株，重复3次。成熟采收前调查烟草黑胫病发病情况，并计算发病率和病情指数[14]。

1.5 病情调查与抗性评价

病害严重度分级标准按照GB/T 23222-2008[14]规定的标准进行。以株为单位分级调查。根据调查结果计算并统计烟株病情指数。

病情指数=∑（各级病株数×该病级值）/（调查总株数×最高病级值）×100。

按照GB/T 23224—2008[11]的规定进行抗性标准评价。高抗或免疫（I），病情指数为0；抗病（R），病情指数为0.1～20.0；中抗（MR），病情指数为20.1～40.0；中感（MS），病情指数为40.1～60.0；感病（S），病情指数为60.1～80.0；高感（HS），病情指数为80.1～100.0。

1.6 数据分析

利用Excel 2007软件对试验数据进行处理，采用DPS软件对不同鉴定方法之间的相关性进行分析。

2 结果与分析

2.1 粗毒素浸种法的抗性鉴定分析

粗毒素浸种试验结果（表1）表明，2个抗病品种革新3号和G28的烟苗发芽率差异显著。革新3号烟苗发芽率达98.0%以上，抗性稳定。抗病品种G28烟苗发芽率与中抗品种金星6007差异不显著。中抗品种金星6007在处理后5 d烟苗发芽率较高，达82.0%，之后随处理时间的增加，其芽苗发芽率逐渐降低。在整个处理期间，金星6007的烟苗发芽率与抗病品种革新3号、感病品种小黄金1025和红花大金元均差异显著。感病品种小黄金1025和红花大金元的烟苗发芽率只在接种后15 d差异显著，在接种后20 d其烟苗发芽率分别降低到62.0%和58.7%。endprint

2.2 粗毒素浸根法的抗性鉴定分析

粗毒素浸根鉴定结果（表2）表明，抗病品种的发病率较低。在接种后15 d，抗病品种革新3号和G28的发病率分别为3.3%、17.7%；中抗品种金星6007的发病率为36.7%；感病品种小黄金1025和红花大金元的发病率分别为30.0%、35.0%。在整个处理期间，中抗品种金星6007的烟苗发病率在5个品种中最高，且接种后5、10 d差异显著。接种后15 d，感病品种与抗病品种的发病率差异显著，与中抗品种的发病率差异不显著。因此，粗毒素浸根法只能对抗病和感病品种进行区分。

2.3 孢子悬浮液浸根法的抗性鉴定分析

由表3可知，抗病品种革新3号和G28的烟苗发病率较低，而感病品种小黄金1025和红花大金元的发病率在接种后5 d已达100.0%，中抗品种金星6007的发病率在接种后15 d达90.0%。接种后10 d，抗病品种革新3号的病情指数最低，其次是G28，感病品种小黄金1025的病情指数最高，其次是红花大金元，中抗品种金星6007处于中间。在整个处理期间，2个感病品种的病情指数差异均不显著，但与抗病品种和中抗品种相比均差异显著。因此，用孢子悬浮液浸根法处理30 d苗龄的烟苗能较快速、准确地鉴定不同种质的抗性水平。

2.4 田间病圃接种法的抗性鉴定分析

田间病圃鉴定结果（表4）显示，抗病品种革新3号和G28的发病率和病情指数分别为16.7%、8.2和7.8%、2.0，属于抗黑胫病种质；金星6007发病率和病情指数分别为28.5%和24.3，属于中抗黑胫病种质；小黄金1025和红花大金元的发病率和病情指数分别为72.6%、64.3和67.7%、59.4，属于感黑胫病种质。

2.5 不同鉴定方法的相关性分析

不同鉴定方法的相关性分析（表5）表明，粗毒素浸种法与孢子悬浮液浸根法的鉴定结果呈显著正相关，相关系数为0.778；孢子悬浮液浸根法与田间病圃接种法的鉴定结果呈显著正相关，相关系数为0.834。由此可见，孢子悬浮液浸根法接种鉴定的结果与粗毒素浸种法和田间病圃接种法的鉴定结果较为一致，可以较好地反映不同品种对烟草黑胫病的抗感特性。

3 小结与讨论

在烟草抗黑胫病新种质创造、抗病新品种选育过程中，抗病鉴定是一个重要的技术环节。本研究所使用的4种抗病鉴定方法，是烟草种质抗性鉴定常规方法，但因病原菌种类以及病原菌的侵入方式不同，其鉴定效果存在不同差异。孙丽萍等[15]研究认为，毒素浸种法不能鉴定烟草种质对赤星病的抗性。本研究用粗毒素浸种法鉴定烟草黑胫病抗性结果显示，这是一种室内初期鉴定方法，简单灵活，不受季节限制，可对烟草黑胫病抗性进行多批量的初期筛选。然而因种子质量影响形成的低发芽率可造成“假感病”的现象，影响毒素浸种法的判定效果。

有学者利用毒素浸根法进行植物抗感种质的筛选鉴定研究，如在烟草赤星病[15]、棉花黄萎病[16]、广藿香青枯病[17]等病害的种质抗性鉴定中均被采用，表现出较好的鉴定效果。在烟草黑胫病抗性鉴定中，粗毒素浸根法可以初步鉴别抗病、感病品种，但是存在着不能区分中感和中抗烟草品种对烟草黑胫病抗性的缺陷。并且该方法粗毒素用量较大，难以确定处理根系时粗毒素的浓度，需反复试验，工作量较大。

孢子悬浮液浸根法与其他3种方法相比，可在接种10 d之内，较为快速、准确地鉴定出不同种质的抗感水平，可观测到整个处理期间烟苗病情指数和发病率的动态变化。此研究结果与于海琴等[18]对烟草苗期黑胫病的鉴定结果一致。田间病圃接种法作为一种常规的鉴定方法，其鉴定结果与孢子悬浮液浸根法的鉴定结果一致，但田间病圃接种法易受环境、接种量、接种时间等的影响[19]。此外，田间病圃接种法所需时间长，占地面积大，试验费用高，并不是最理想的方法。

因此，在烟草黑胫病抗性鉴定过程中，孢子悬浮液浸根法较其他3种方法更能准确、合理地评价品种抗性。粗毒素浸根法和田间病圃接种法有一定缺陷，可作为粗毒素浸种法和孢子悬浮液浸根法的辅助鉴定方法。

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