混合菌种发酵牛骨粉制备血管紧张素转换酶抑制肽

刘丽莉，梁严予，尹光俊，李　丹，杨陈柳

(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023)



混合菌种发酵牛骨粉制备血管紧张素转换酶抑制肽

刘丽莉，梁严予，尹光俊，李丹，杨陈柳

(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023)

利用蜡样芽孢杆菌(B.cereus)MBL 13-U、植物乳杆菌(Lp)和嗜热链球菌(St)混合发酵牛骨粉，制备牛骨血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽。通过正交试验，以胶原多肽质量浓度为指标，确定最佳菌种体积比为V(B.cereusMBL 13-U)∶V(Lp)∶V(St)=1∶1∶1，蔗糖添加量(质量分数)为2.5%，骨粉添加量(质量分数)为3.5%。在单因素试验基础上采用中心组合试验设计，以ACE抑制率为指标，确定最佳发酵工艺条件：接种量(质量分数)为4%，发酵温度为37 ℃，发酵时间为42 h，发酵液初始pH值为7.0。经验证试验，在最佳发酵条件下，多肽液的ACE抑制率最高为(51.73±0.65)%。针对牛骨ACE抑制肽的特性，得到混合菌种发酵牛骨粉的最佳工艺参数。

混合菌种；发酵；牛骨ACE；胶原多肽

0　引言

近年来，中国已成为世界上高血压致死率最高的国家，平均每年有400万的新增高血压病患者，并向青年化发展[1-2]，但目前市售的降血压药物效果均不理想或副作用较大。研究表明：降血压肽具有降血压、免疫促进和抗凝血等功能[3]，因此，对天然、高效、预防和治疗高血压的食源性胶原多肽产品的开发逐渐成为研究热点[4]。文献[5]综合比较了多种不同发酵食品的降血压活性，发现大豆和干酪等食品经发酵后含有较高活性的降血压肽。文献[6]通过酶解鸡腿骨蛋白制备了降血压肽，并测定了酶解过程中的pH值、肽质量浓度和水解度。文献[7]依次采用碱性蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶对猪股骨胶原蛋白进行酶解，以制备降血压肽。牛骨虽然是胶原蛋白的优良资源，但因得不到合理利用大部分被丢弃，造成了资源浪费和环境污染。因此，充分利用牛骨资源，将胶原蛋白经酶降解为相对分子质量较低的牛骨降血压肽，具有重大的经济及现实意义。

目前，对胶原多肽的制备常采用酶解法[8]，此方法条件温和、操作安全、过程易控制，但缺点是具有一定的不定向性、产品纯度不高、酶制剂的成本较高及易产生苦味肽等。文献[9-10]发现微生物复杂的生理生化机制在降解蛋白的同时，还能使过程中产生的苦味肽物质得到转化从而达到脱苦的目的，但在实际研究中发现采用单一菌种纯种发酵有很大的局限性，发酵液中蛋白酶活力低，从而使产品中多肽质量浓度较低。因此，本文采用产胶原蛋白酶的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus，B.cereus)MBL 13-U菌株结合植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum,Lp)和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus,St)混合发酵牛骨粉制备血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽。以发酵时间、发酵温度和发酵液初始pH值等为单因素，以胶原多肽质量浓度和ACE抑制率为指标，对混合菌种发酵工艺进行了优化，得到混合菌种发酵牛骨粉的最佳工艺参数，为工业化生产提供科学的理论依据。

1　材料与仪器

1.1材料与试剂

新鲜牛腿骨，购于洛阳市老城区某农贸市场；蜡样芽孢杆菌(B.cereus)MBL 13-U由本课题组筛选诱变所得；嗜热链球菌(St)和植物乳杆菌(Lp)，购于上海纪宁试剂有限公司。蔗糖、蛋白胨、牛肉膏、乙酸钠、骨明胶、氯化钠、氯化钙、硫酸镁和琼脂粉等购于天津德恩有限公司，均为分析纯。

1.2仪器与设备

MXX1400-40型万用电炉，济南鑫贝西生物有限公司生产；PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器有限公司生产；DZKW型电热恒温水浴锅，北京永光明医疗仪器有限公司生产；DHG-9013A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司生产。

1.3主要培养基

B.cereusMBL 13-U种子培养基(100 mL)：含蔗糖1.00 g，骨明胶2.00 g，磷酸氢钠 0.05 g，磷酸氢钾 0.25 g，氯化钙0.05 g。pH值7.0～7.2。

Lp种子培养基(100 mL)：含蛋白胨1.00 g，牛肉膏1.00 g，酵母膏0.50 g，葡萄糖0.50 g，磷酸氢钾 0.20 g，硫酸镁 0.05 g，吐温80 0.10 g，硫酸锰 0.025 g。pH值6.5。

St种子培养基(100 mL)：含胰蛋白胨2.00 g，蔗糖0.50 g，酵母提取物0.50 g，骨明胶0.25 g，乙酸钠 0.15 g，葡萄糖0.50 g，抗坏血酸0.05 g，乳糖0.50 g，琼脂1.50 g。pH值6.8。

2　试验与测定方法

2.1试验步骤

试验步骤为：牛腿骨→预处理→牛骨粉(100目过筛)→发酵液→灭菌→接种→发酵→灭菌→离心取上清液→超滤分离纯化→真空冷冻干燥→牛骨ACE抑制肽[11]。

表1　单因素试验因素与水平表

采用固定的发酵培养条件：菌种体积比V(B.cereusMBL13-U)∶V(Lp)∶V(St)=1∶1∶1，蔗糖添加量(质量分数)为1.5%，牛骨粉添加量(质量分数)为3%，接种量为3%，在37 ℃、pH 7.0、180 r/min摇床振荡培养48 h。以菌种体积比V(B.cereusMBL13-U)∶

V(Lp)∶V(St)分别为1∶0∶0、1∶1∶0、1∶0∶1、

1∶1∶1、2∶1∶1、1∶1∶2、1∶2∶1，蔗糖添加量分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，骨粉添加量分别为2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%为单因素，发酵液中胶原多肽含量为指标，在单因素试验基础上通过三因素三水平正交试验确定最佳发酵培养基组合。单因素试验因素与水平表见表1。

为提高发酵效率，在优化最佳发酵培养基的基础上，选择以接种量、发酵温度、发酵时间和发酵液初始pH值4个因子为变量，以ACE抑制率为指标，利用中心组合设计(central composite design,CCD)对影响发酵的因素条件进行了优化。

2.2测定方法

发酵液中胶原多肽质量浓度的测定采用双缩脲法：配制不同浓度梯度的牛血清白蛋白标准溶液，各取 6.0 mL 分别与4.0 mL的双缩脲试剂充分混匀，静置30 min后在λ=540 nm处测定吸光度(optical density，OD)值，绘制多肽的标准曲线。加5 mL三氯乙酸溶液至5 mL牛骨粉发酵液中，混合均匀后静置10 min，5 000 r/min离心10 min，取上清液1 mL加入4 mL双缩脲试剂，于漩涡混合仪上混合均匀，静置10 min。取上清液在540 nm处测其OD值，通过标准曲线求得样品的多肽质量浓度。

ACE抑制率的测定采用紫外比色法：取50 μL、5.0 mmol/L 马尿酰组胺酰亮氨酸与10 μL发酵上清液混匀，37 ℃水浴预热5 min，加入10 μL、0.1 U/mL ACE，37 ℃水浴反应1 h，加入75 μL、1.0 mol/L 盐酸终止反应。加入0.6 mL乙酸乙酯充分混匀后，4 000 r/min离心10 min。取1 mL乙酸乙酯置于试管中放入烘箱，110 ℃挥发60 min后用4 mL蒸馏水溶解，充分混合30 s，在波长228 nm处测定其OD值。 ACE抑制率(%)=(B-A)×100/(B-C)，其中：A为加入ACE抑制剂的样品OD值；B为不加ACE抑制剂的样品OD值；C为不加ACE的样品OD值。

采用Origin 8.5和Design-Expert 8.05软件进行数据分析，并作响应面及等高线图。

2.3牛骨ACE抑制肽的结构分析

取少量牛骨ACE抑制肽样品均匀涂抹于扫描电镜(scanning electron microscop,SEM)样盘双面胶上，进行喷金镀膜处理后置于扫描电镜抽真空，调整电压，放大不同倍数获取清晰扫描图像。

室温条件下，取0.50 g分离干燥的牛骨ACE抑制肽溶于30 mL去离子水，将其置于紫外-可见光扫描仪上200～450 nm进行扫描[12]。

3　结果与分析

3.1正交试验确定培养基最佳比例

3.1.1单因素试验

当混合菌种体积比V(B.cereusMBL 13-U)∶V(Lp)∶V(St)=1∶1∶1时，测得的发酵液中胶原多肽质量浓度最大为3.67 mg/mL；当蔗糖添加量为2.5%时，发酵液中的胶原多肽质量浓度达到最大值2.81 mg/mL；当骨粉添加量为3.0%时，胶原多肽质量浓度达到最大值3.38 mg/mL。

在上述单因素试验的基础上，针对菌种体积配比(A)、蔗糖添加量(B)和骨粉添加量(C)3个因素，以胶原多肽质量浓度为指标，采用L9(34)正交表进行试验，确定最佳发酵培养基组成。

3.1.2正交试验

因素主次为A>B>C，即对胶原多肽质量浓度影响最大的因素是混合菌种的体积配比，其次是蔗糖添加量，最后是骨粉添加量，且综合评价最佳组合为A2B2C2。从而确定最佳菌种体积比为V(B.cereusMBL 13-U)∶V(Lp)∶V(St)=1∶1∶1，蔗糖添加量为2.5%，骨粉添加量为3.5%。

3.2接种量对胶原多肽质量浓度和ACE抑制率的影响

混合菌种接种量对发酵过程中胶原多肽质量浓度和ACE抑制率的影响如图1所示。由图1可知：随着接种量的增加，在接种量为4%时，胶原多肽质量浓度达到最大值3.62 mg/mL；超过4%时，胶原多肽质量浓度和ACE抑制率均显著降低，这可能是由于随着活菌数的逐渐增多，水解黏度增大，水解速度降低，对水解反应有抑制作用，且菌种增多的同时需要大量氮源，导致多肽被菌体利用而减少。因此，选择混合菌种的最佳接种量为4%。

3.3发酵温度对胶原多肽质量浓度和ACE抑制率的影响

发酵温度对发酵过程中胶原多肽质量浓度和ACE抑制率的影响如图2所示。随着发酵温度的升高，胶原多肽质量浓度和ACE抑制率均呈现先上升后下降的趋势，胶原多肽质量浓度在37 ℃时达到最大值3.36 mg/mL，ACE抑制率在40 ℃时达到最大值34.12%，这与温度对于菌体生长以及酶活力的影响有关。且40 ℃以上，胶原多肽质量浓度的减少幅度明显增大，说明发酵温度对胶原多肽质量浓度影响较大。因此，选择最佳发酵温度为37 ℃。

图1　接种量对胶原多肽质量浓度和ACE抑制率的影响

图2　发酵温度对胶原多肽质量浓度和ACE抑制率的影响

3.4发酵时间对胶原多肽质量浓度和ACE抑制率的影响

发酵时间对发酵过程中胶原多肽质量浓度和ACE抑制率的影响如图3所示。由图3可知：随着发酵时间的延长，ACE抑制率增加，在42 h时达最大值33.69%，之后呈现下降趋势。胶原多肽质量浓度也随发酵时间的延长呈现先上升后下降的趋势，在发酵48 h时达到最大值，这可能是由于过长的发酵时间破坏了牛骨粉中的营养成分，从而抑制了酶系统的水解作用，导致ACE抑制肽的减少。综合考虑胶原多肽质量浓度和ACE抑制率，选择最佳发酵时间为42 h。

3.5发酵液初始pH值对胶原多肽质量浓度和ACE抑制率的影响

发酵液初始pH值对发酵过程中胶原多肽质量浓度和ACE抑制率的影响如图4所示。由图4可知：当发酵液初始pH值升高，胶原多肽质量浓度和ACE抑制率值均呈现先上升后下降的趋势。在发酵液初始pH值为6.5时，胶原多肽质量浓度达到最大值3.60 mg/mL；初始pH值升到7.0时，ACE抑制率达到最大值37.36%。综合考虑，选择最佳发酵液初始pH值为6.5。

图3　发酵时间对胶原多肽质量浓度和ACE抑制率的影响

图4　发酵液初始pH值对胶原多肽质量浓度和ACE抑制率的影响

3.6中心组合设计优化发酵工艺条件

在上述单因素试验的基础上，对影响牛骨粉发酵的工艺条件进行优化，以菌种接种量(X1)、发酵温度(X2)、发酵时间(X3)和发酵液初始pH值(X4)4个因子为变量，以ACE抑制率为指标，进行CCD试验设计。再利用Design-Expert 8.05软件对试验数据进行统计分析，得到二次项回归方程为：

0.099 306X2X3-0.725X2X4-1.683 33X3X4。

对回归方程进行方差分析，结果见表2。

表2　中心组合设计回归模型方差分析

图5　ACE抑制率响应面等高线图

由图5及回归方程得到发酵工艺最优组合为：接种量为4%，发酵温度为37 ℃，发酵时间为42 h，发酵液初始pH值为7.0，多肽液的ACE抑制率理论最高值为52.07%。由于该组合不在所列试验中，为了验证回归模型的有效性，在利用最优工艺组合情况下，进行3组验证试验，求得平均值为(51.73±0.65)%，偏差绝对值小于2%，说明本试验建立的回归模型能较好地描述因素与指标的关系。

3.7牛骨ACE抑制肽扫描电镜和紫外扫描结果

牛骨ACE抑制肽经放大25 000倍的扫描电镜照片如图6所示，牛骨ACE抑制肽表面出现了明显的沟壑痕迹，可能是由于牛骨ACE抑制肽的亲水区具有较强的吸湿性，接触空气后极易吸水，在扫描过程中的真空环境下失水所造成的。

牛骨ACE抑制肽的紫外(ultraviolet，UV)扫描结果如图7所示。文献[13]研究表明：在波长200～230 nm，胶原多肽的羰基及肽键有特征吸收峰。牛骨ACE抑制肽的UV扫描在波长214～222 nm出现强吸收峰，在280 nm处无吸收峰出现，这是因为牛骨胶原蛋白水解后得到的ACE抑制肽链中含有的CO—NH2、C—O和—COOH都是生色基团，能够在220 nm左右产生光吸收[14]。因此，所制备的ACE抑制肽符合胶原多肽的吸收特性。

图6　牛骨ACE抑制肽的SEM照片

图7　牛骨ACE抑制肽紫外扫描图

4　结论

(1)分别以蔗糖为碳源、牛骨粉为氮源，以发酵液中胶原多肽质量浓度为指标，采用3因素3水平正交试验，确定最佳发酵培养基组合为：菌种体积比为V(B.cereusMBL 13-U)∶V(Lp)∶V(St)=1∶1∶1，蔗糖添加量为2.5%，骨粉添加量为3.5%。

(2)选择混合菌种接种量、发酵温度、发酵时间和发酵液初始pH值为因素，以胶原多肽质量浓度和ACE抑制率为指标，确定各因素最佳值：接种量为4%，发酵温度为37 ℃，发酵时间为42 h，发酵液初始pH值为6.5。

(3)在单因素试验基础上，采用中心组合试验设计，选择ACE抑制率为指标，通过响应面和回归方程得到最佳发酵工艺：接种量为3%，发酵温度为37 ℃，发酵时间为42 h，发酵液初始pH值为 7.0，此时多肽液的ACE抑制率理论最高值为52.07%。经验证试验测得试验值为(51.73±0.65)%，表明试验建立的回归模型能较好地对混合菌种发酵牛骨粉制备ACE抑制肽进行预测。

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国家自然科学基金项目(31401622);河南省重点攻关基金项目(152102110080);河南省教育厅自然科学研究基金项目(13A550255);河南科技大学高级别项目培育基金项目(2013ZCX012);国家农业部公益性行业(农业)科研专项基金项目(201303084)

刘丽莉(1974-),女,河南商丘人，副教授,博士,硕士生导师，主要研究方向为畜产品加工技术.

2016-05-26

1672-6871(2017)01-0067-06

10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2017.01.014

TS253.1

A