C—反应蛋白损伤内皮细胞的蛋白质组学研究

刘少军　胡坤华　刘慰华

【摘要】 目的：从蛋白质组学的角度探讨C-反应蛋白（CRP）损伤内皮细胞（EC）的作用机制。方法：采用培养的人冠状动脉内皮细胞HCAEC第4代用于实验，25 ?g/mL CRP刺激HCAEC 24 h，2D DIGE结合MALDI-ToF-ToF质谱鉴定进行蛋白质组学分析研究。结果：发现差异表达蛋白斑点11个，鉴定出其中4个，包括Heat shock cognate 71 kDa protein、Elongation factor 1-beta和Proteasome activator complex subunit 1等。结论：通过蛋白质组学研究，筛选了CRP损伤EC的差异表达蛋白，为深入理解EC损伤的分子机制提供有益的线索。

【关键词】 C-反应蛋白； 内皮细胞； 蛋白质组学研究； 动脉粥样硬化

Proteomics Analysis of C-relative Protein Effect on Endothelial Cell/LIU Shao-jun，HU Kun-hua，LIU Wei-hua.//Medical Innovation of China，2017，14（19）：015-018

【Abstract】 Objective：To investigate the role of CRP in endothelial cell by proteomics analysis.Method：Human coronary artery endothelial cells were used at passage 4.25 ?g/mL CRP served as stimulus for endothelial cell injury.Differentially expressed proteins were analyzed by 2D DIGE and identified by MALDI-ToF-ToF MS analysis.Result：Differentially expressed 11 spots were visualized and 4 were identified，including Heat shock cognate 71 kDa protein， Elongation factor 1-beta and Proteasome activator complex subunit 1.Conclusion：This study screen differentially expressed proteins by CRP stimulus via proteomics analysis，providing useful understand of the underlying molecular mechanism of endothelial cell injury.

【Key words】 C-relative protein； Endothelial cell； Proteomics analysis； Atherosclerosis

First-authors address：Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.19.005

在正常血清中，CRP（C-reactive protein，CRP）以微量形式存在。當发生炎症时，炎症因子刺激肝细胞产生CRP，血清CRP显著升高。因此，CRP是一个炎症反应的标志分子。大量研究表明，CRP与动脉粥样硬化的发生发展密切相关[1-7]。CRP对内皮细胞（endothelial cells，EC）的损伤主要存在以下几个方面：（1）激活补体经典途径，进而攻击内膜；（2）促进EC释放内皮素及IL-6；（3）下调一氧化氮合酶的mRNA和蛋白的表达，从而抑制一氧化氮的表达与合成；（4）诱导细胞粘附因子的表达和释放，从而诱导单核免疫细胞粘附聚集。笔者前期工作也报道了CRP诱导EC损伤的分子机制[8-10]。蛋白质组学是一种较新较前沿的研究方法，具有系统性、高通量、高灵敏度等特点[11-12]。本研究中，笔者首次采用蛋白质组学的方法，从系统生物学的角度探讨CRP损伤EC的分子机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验设计 本研究采用2D DIGE研究的标准设计，方案见表1。

1.2 试剂和仪器 CRP购买自Trichem Rsources及Calbiochem公司，CRP的透析参照笔者之前的文章进行[10]。硫脲、赖氨酸、二甲基甲酰胺购自美国Sigma公司，尿素、CHAPS、玻璃板硅烷化剂、甘氨酸、低熔点琼脂糖、固相IPG干胶条、IPG buffer、蛋白质纯化试剂盒Clean-up Kit、定量试剂盒Quant Kit、荧光标记试剂盒[CyDye DIGE Flour （minimal Dye） Labelling Kit]、Deep purple荧光染料、三氟乙酸均购自GE Healthcare公司，正丁醇为德国Merck公司产品。乙腈购自美国Fisher公司，测序级胰酶购自美国Promega公司。IPGphor Ⅲ等电聚焦电泳仪，Ettan DALT Six System SDS垂直电泳仪，Typhoon Trio扫描仪、Ettan Picker、Ettan Digester、DeCyder V7.0 Software均为GE Healthcare公司产品。MALDI-ToF-ToF质谱仪为美国Bruker Dalton公司生产。

1.3 HCAEC的培养及处理 人冠状动脉内皮细胞（HCAEC），购买自Cell Applications公司，HCAEC的培养按照说明书进行。本研究使用的HCAEC为第4代，实验处理细胞之前，改为含0.1% FBS且不含细胞因子的EGM-2基础培养基培养24 h。实验组为HCAEC用25 μg/mL CRP处理24 h。endprint

1.4 样品处理 在4 ℃预冷Tris-buffered sucrose solution（10mM Tris，250mM sucrose）中洗涤细胞，重复3次去除残余培养基。每个10 cm皿中加入Standard lysis buffer（7M Urea，2M Thiourea，30mM Tris，4% CHAPS，）300 μL，刮下細胞并充分裂解，超声破碎。4 ℃，20000 g离心30 min，转移上清液进行蛋白质纯化。蛋白质的纯化和定量严格按照2D Clean-up Kit或2D Quant Kit说明书进行。

1.5 2D DIGE 样品的荧光标记按照笔者已经报道过的方法进行操作[13-14]，简述如下：按照2D DIGE实验设计，在4 ℃条件下，每个样品50 μg用400 pmol Cy2、Cy3或者Cy5 在冰浴、避光条件下标记30 min，然后用Lysine solution终止反应。第一向等电聚焦程序如下：30 V，12 h，step-n-hold；500 V，1 h，step-n-hold；1000 V，1 h，step-n-hold；10 000 V，10 h，step-n-hold；Total：90 000Vh。用DTT和IAA进行两步平衡后进行第二向SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE凝胶为12.5%。

1.6 DIGE凝胶扫描和差异蛋白的获取 在进行2D DIGE分析胶电泳的同时，另外准备2张制备胶（500 μg/胶），按照Deep Purple stain kit操作说明进行制备胶的荧光染色，用Typhoon Trio扫描仪进行2D DIGE分析胶和Deep Purple制备胶的图像采集，用DeCyder7.0软件进行分析，在Ettan Picker上获取差异蛋白质样品。

1.7 蛋白质鉴定 获取的目的蛋白斑点在Ettan Digester上进行酶解。之后在MALDI-ToF-ToF质谱仪上进行蛋白鉴定，Mascot进行检索。

2 结果

2.1 CRP刺激EC的2D DIGE差异分析 本研究按实验设计操作共获得4张2D DIGE凝胶，每张2D DIGE凝胶经过三种不同波长的激光扫描后，可以得到3个分别由Cy2、Cy3和Cy5荧光标记的不同处理的样品图像及合并（merge）的胶内差异凝胶图像（图1显示其中一张分析胶）。通过DeCyder7.0软件的自动匹配和随后的人工核对，检测到（2231±389）个蛋白斑点，不同处理组间的匹配率都接近80%，符合分析的标准。经过仔细分析，共发现差异大于1.5倍的蛋白质斑点11个，其中CRP处理组上调9个（斑点926、951、959、1921、1972、1989、1993、1994和1996），下调的斑点2个（1793和1889），见图1。

2.2 质谱鉴定及数据库检索 接着对此11个蛋白斑点进行MALDI-TOF-TOF质谱鉴定，其中有6个斑点获得了较好的谱图，经Mascot检索成功鉴定出4个蛋白质（其中斑点926与951为同一个蛋白，斑点1993与1994为同一个蛋白质），鉴定出来的差异表达蛋白见表2。

2.3 CRP诱导表达差异的蛋白 CRP诱导EC上调表达的蛋白有HSPA8（Heat shock cognate 71 kDa protein）（图2A）和PSME1（Proteasome activator complex subunit 1）（图2B）。HSPA8是热应急蛋白质HSP70家族的一员。而PSME1属于蛋白降解系统的蛋白质。该发现提示，CRP可能一方面促使EC应激，另外一方面促进异常蛋白质的降解。蛋白EEF1B2（Elongation factor 1-beta）为本研究发现的CRP诱导EC表达下调的蛋白（图2C），EEF1B2的主要功能是参与蛋白质的翻译延长过程。该结果提示，CRP可能通过下调表达EEF1B2而抑制蛋白质的翻译。

3 讨论

2D DIGE引入了内标的概念，最大限度的消除了凝胶之间实验误差引起的差异，因此2D DIGE检测的蛋白质差异数据更精确、更可靠。其次，2D DIGE采用荧光标记的方法，与传统的后染色双向电泳比较很大程度上提高了检测灵敏度，使得检测到的可能的差异蛋白质数量增加。本研究每张凝胶平均检测到2231个蛋白斑点，而且凝胶之间匹配率都接近80%，说明灵敏度和精确度还是比较好的。

CRP（C-reactive protein，CRP）主要功能是调理感染，激活补体系统，参与细胞的凋亡。大量的研究表明，CRP能够活化内皮细胞（endothelial cells，EC）和损伤内皮功能[15]，而且降压药物有较明显的保护性干预作用[16]。Turu等[17]用TaqMan Low-density Arrays的方法鉴定出与CRP损伤EC相关的基因6个，有关学者则用芯片分析的方法发现CRP诱导EC的11个基因表达差异[12]。本研究采用2D DIGE结合MALDI-ToF-ToF的方法从蛋白质组学研究的角度探索CRP损伤EC的可能分子机制，筛选鉴定出4个差异表达蛋白。

HSPA8是热应急蛋白质HSP70家族的一员，热休克蛋白是细胞内古老的分子之一，是一种保护性的蛋白质。也是一种常见的分子伴侣。受到外界刺激时，热休克蛋白被大量合成，帮助细胞来维持正常的生理活动，阻止蛋白质的相互作用和聚集。此外，HSPA8还是一个转录激活的抑制子，发挥抑制转录的功能[18]。CRP刺激EC细胞造成应激，诱导热休克蛋白的表达上调，可能发挥代偿性保护细胞的作用。PSME1属于蛋白降解系统[19]，CRP刺激EC时诱导其表达上调。CRP一方面促进蛋白质的正确折叠，另外一方面可能促进异常蛋白质的降解。EEF1B2的主要功能是作为鸟嘌呤核苷酸交换因子参与蛋白质的翻译延长过程[20]，CRP可能通过下调表达EEF1B2进而抑制蛋白质的翻译。endprint

值得注意的是，斑点1993和1994在CRP处理组表达明显上升，而这两个斑点经质谱鉴定恰恰就是CRP本身。这说明虽然在本研究中，裂解蛋白之前使用Tris-buffered sucrose solution对细胞进行了3次洗涤，但是并没有完全清除掉CRP蛋白本身，处理组存在CRP遗留下来的“蛋白污染”。一个重要的可能原因是：CRP与其EC上的受体CD32、CD64结合紧密有关[1-3]。

CRP对EC的损伤作用是比较明确的，但是本研究发现的差异蛋白比实验前预计的少，只有11个。其中一个可能的原因是，刺激EC的CRP浓度偏低（25 μg/mL），一般认为中位浓度为50 μg/mL[3]。另外一个可能的原因是，目前对于CRP损伤EC的作用大多报道的是信号通路分子，比如蛋白激酶。而信号通路分子的蛋白丰度一般都比较低，以2D DIGE的灵敏度比较难检测出来。

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（收稿日期：2017-03-16） （本文編辑：周亚杰）endprint