Wnt10a/Wnt10b及其Wnt/β—catenin通路在子宫内膜癌患者中的作用机制研究

卢宇青

【摘要】 目的：观察Wnt10a/Wnt10b及其Wnt/β-catenin通路在子宫内膜癌患者中的表达及作用机制。方法：选取2015年1月-2016年7月医院收治子宫内膜癌患者102例，均经过病理确诊，设为观察组，其中95例雌激素依赖型子宫内膜癌，7例非雌激素依赖型子宫内膜癌。选取同期入院子宫内膜增生疾病诊断患者48例，设为对照组。入院后采集相关标本，制作组织芯片，采用免疫组化SP法检测两组Wnt10a/Wnt10b表达水平，采用Western-blot法检测不同组织标本关键蛋白的表达含量。结果：观察组中Wnt10a及Wnt10b阳性表达率，高于对照组（P<0.05）；观察组中雌激素依赖型子宫内膜癌Wnt10a阳性率，高于非雌激素依赖型子宫内膜癌（P<0.05）；观察组中雌激素依赖型子宫内膜癌Wnt10b阳性率，低于非雌激素依赖型子宫内膜癌（P<0.05）；Wnt10a在观察组中呈阳性表达，组织排列无规律性，在对照组中呈阴性表达，组织排列相对整齐。Wnt10b在观察组中多呈阳性表达，组织排列缺乏规律性，对照组中呈阴性表达，组织排列相对整齐。Western-blot法结果显示，子宫内膜癌患者中，Wnt10b表达水平增加，并且β-catenin及c-myc表达均得到增加，APC表达下降。结论：Wnt10a/Wnt10b在子宫内膜癌发生、发展中发挥了重要作用，其机理与经典Wnt/β-catenin信号传导通路激活有关。

【关键词】 Wnt10a/Wnt10b； Wnt/β-catenin通路； 子宫内膜癌； 表达； 作用机制

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.19.007

子宫内膜癌（EC）是原发于子宫内膜的上皮性恶性肿瘤，是女性生殖器三大恶性肿瘤之一，好发于58～61岁人群中，随着人口老龄化的日益加剧，导致EC发生率呈现上升及年轻化趋势[1]。有关报道显示，EC发生率占女性癌症总数的20.0%～30.0%，其发生率已经超过宫颈癌发生率[2-3]。临床上，根据发病原因将EC分为雌激素依赖型（Ⅰ型，占85.0%）和非雌激素依赖型（Ⅱ型）。目前，临床上对于EC发病机制尚不完全知晓，多与肥胖、持续性雌激素刺激、高血压及糖尿病有关。文献[4-5]报道显示，Wnt基因及经典传导通路在结直肠癌、胃癌、乳腺癌、宫颈癌中发挥了重要的作用，该通路中关键蛋白β-catenin的失活突变在EC中约占10.0%～45.0%，但是其作用机制尚存在较大的争议。为了探讨Wnt10a/Wnt10b及其Wnt/β-catenin通路在子宫内膜癌患者中的表达及作用机制，选取2015年1月-2016年7月本院收治子宫内膜癌患者102例，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年1月-2016年7月本院收治子宫内膜癌患者102例，其中95例雌激素依赖型子宫内膜癌，7例非雌激素依赖型子宫内膜癌；年龄35～78岁，平均（58.5±4.1）岁。纳入标准：（1）符合子宫内膜癌临床诊断标准[6-7]；（2）均经过生化指标、影像学检查及组织形态学检查得到确诊；（3）均伴有不同程度的阴道不规则出血、下腹痛、月经紊乱等；（4）本课题均经过医院伦理委员会批准同意，自愿签署知情同意书。排除标准：（1）不符合子宫内膜癌临床诊断标准者；（2）资料不全或难以配合治疗者；（3）合并心、肝、肾功能异常者。选取同期入院子宫内膜增生疾病诊断患者48例，设为对照组，年龄34～79岁，平均（59.1±4.4）岁。两组患者的年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 方法 入院后采集相关标本，制作组织芯片，采用免疫组化SP法检测两组Wnt10a/Wnt10b表达水平；采用Western-blot法检测不同组织标本Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白的表达含量。（1）组织芯片制备：取两组手术病理切除组织，对蜡块的HE切片做镜下形态学观察，圈出EC组织及非EC组织的形态学特点的位置，在蜡块上确定取样的部位，利用组织芯片打孔仪对蜡块穿取组织芯[8]。（2）Wnt10a/Wnt10b表达水平：将组织芯片蜡块以3 μm连续切片，将获得的标本完整切片进行常规HE染色，然后采用免疫组化SP法检测两组Wnt10a/Wnt10b表达水平，将芯片内不同类型组织作为内对照，以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照，相关操作步骤必须严格遵循仪器、试剂盒操作说明进行[9-10]。（3）Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白表达：采用Western-blot法检测不同组织标本关键蛋白的表达含量，取上述采集的标本组织，根据50体积BCA试剂A试剂B配制BCA工作液，充分混匀。完全溶解BSA蛋白标准品，取10 μL稀释到100 μL，控制最终浓度为0.5 mg/mL。将标准品根据0、1、2、4、8、12、16 μL加入到96孔板中，向每孔中加入200 μL BCA工作液，37℃下进行30 min放置，采用酶标仪测定波长在592 nm下的吸光度值。将上述标本采用SDS-聚丙烯酰胺蛋白经过制胶、上样、电泳，制备半干式电转膜，将其放入封闭液中，采用TBST进行3次冲洗，5 min/次，采用封闭液稀释一抗，放入4 ℃下孵育过夜，摇床上轻微振动。利用封闭液稀释辣根过氧化物酶标记二抗IgG，混合在1 mL双蒸馏水中，使之完全覆盖PVDF膜，在暗室内曝光、显影、定影[11-12]。

1.3 结果判定 采用PBS液置换一抗作为阴性对照，采用Wnt10a染色已知结肠癌组织切片作为阳性对照，Wnt10b采用已知阳性乳腺癌组织作为阳性对照[13]。

1.4 統计学处理 使用SPSS 18.0统计软件进行处理，计量资料采用（x±s）表示，比较行t检验，计数资料采用率（%）表示，比较采用检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果endprint

2.1 两组Wnt10a及Wnt10b表达情况比较 观察组中Wnt10a及Wnt10b阳性表达率，高于对照组（P<0.05）；观察组中雌激素依赖型子宫内膜癌Wnt10a阳性率，高于非雌激素依赖型子宫内膜癌（P<0.05）；观察组中雌激素依赖型子宫内膜癌Wnt10b阳性率，低于非雌激素依赖型子宫内膜癌（P<0.05），见表1。

2.2 Wnt10a及Wnt10b在两组中的表达情况 采用免疫组织化学SP法测定Wnt10a及Wnt10b在两组中的表达，Wnt10a在观察组中呈阳性表达，组织排列无规律性，在对照组中呈阴性表达，组织排列相对整齐。Wnt10b在观察组中多呈阳性表达，组织排列缺乏规律性，对照组中呈阴性表达，组织排列相对整齐，見图1。

2.3 Wnt/β-catenin通路在子宫内膜癌患者中的表达 通过采用Western-blot法检测不同组织标本关键蛋白的表达含量，结果显示：子宫内膜癌患者中，Wnt10b表达水平增加，并且β-catenin及c-myc表达均得到增加，APC表达下降，见图2。

3 讨论

子宫内膜癌（EC）是临床上常见的恶性肿瘤，患者发病早期临床症状缺乏特异性，多数患者一旦确诊已经是中、晚期，从而错过了最佳治疗时机[14]。文献[15-16]报道显示：Wnt10a/Wnt10b及Wnt/β-catenin信号传导在EC的发生、发展有关，能促进肿瘤的发生，但是其具体机制尚存在较大的争议。Wnt基因最早由国外学者在1982年发现并报道，是小鼠乳腺癌中克隆出的一种原癌基因，能在细胞间传递增殖分化信号的蛋白质，成为Int基因。Wnt10a/Wnt10b均为Wnt基因家族中比较重要的成员，其传代信号能引起细胞内β-catenin水平升高并进入核内，通过与TCF结合，调节相关靶基因控制其转录和表达，从而影响细胞的增殖和凋亡，通过这种途径能激活细胞内信号通路。文献[16]报道显示，Wnt信号蛋白在多种恶性肿瘤中表达增高。Wnt10a在胃癌和结直肠癌的研究相对较多，而在子宫内膜癌的表达研究较少，多与肿瘤的直径、浸润深度、淋巴结转移、分化程度及5年生存率有关。从本课题研究结果看出：Wnt10a在子宫内膜癌发生中能发挥一定的作用，并且Wnt10b在正常子宫内膜到异常增生子宫内膜直到癌变子宫内膜均具有较高的阳性表达率，提示Wnt10b能促进子宫内膜的发生及发展[17]。本研究中，观察组Wnt10a及Wnt10b阳性表达率，高于对照组（P<0.05）；观察组中雌激素依赖型EC Wnt10a阳性率，高于非雌激素依赖型EC（P<0.05）；观察组中雌激素依赖型EC Wnt10b阳性率，低于非雌激素依赖型子宫内膜癌（P<0.05）。

EC被认为是一种雌激素依赖性肿瘤，其发生于发展和Wnt信号传统通路之间可能属于是一种无抵抗雌激素导致Ⅰ型EC的机制之一。Wnt10a/Wnt10b及其Wnt/β-catenin通路通过促进Wnt基因及蛋白的表达，能进一步提高Wnt信号传导通路的活化，有助于靶基因关键蛋白水平的提高，从而能促进子宫内膜组织的恶性转化[18]。β-catenin通路最初是作为细胞黏附分子被人们认识的，因近年发现其在Wnt/β-catenin信号传导通路及某些肿瘤的发生中具有重要的作用而广泛受到关注。从大的角度来说，β-catenin是由CTNNB1基因编码，主要定位于染色体3P21、3P22中，该因子具有16个外显子，全长2312Kb，分子量为92-95KD，含有781个氨基酸。β-catenin蛋白主要是通过结合型与游离型的方式存在于细胞浆中，能与Ecadherin相互作用，并且能直接将细胞外粘附因子与胞质内的细胞骨架相互结合，从而在细胞膜表面形成复合体，有助于维持上皮细胞极性和完整性。同时，游离的β-catenin能与GSK3β，APC和Axin形成复合物，复合物中的β-catenin可以被磷酸化，从而被蛋白酶体降解。有关研究显示，β-catenin是经典Wnt/β-catenin信号通路的下游中相对重要的蛋白之一，在Wnt信号通路中发挥了重要的作用，通过β-catenin核内水平的增加能引起一系列转录基因活性的增强，诱导细胞发生恶性病变。有关研究显示，Wnt/β-catenin在肝癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌及EC中均具有异常表现，并且其异常表达与肿瘤的发生、发展关系密切。本研究中，通过采用Western-blot法检测不同组织标本关键蛋白的表达含量，结果显示EC患者中，Wnt10b表达水平增加，并且β-catenin及c-myc表达均得到增加，APC表达下降。由此看出：Wnt10a/Wnt10b及其Wnt/β-catenin通路在EC患者中参与雌激素水平的调节，促进肿瘤的发生及发展。

综上所述，Wnt10a/Wnt10b在EC发生、发展中发挥了重要作用，其机理与经典Wnt/β-catenin信号传导通路激活有关，能促进β-catenin表达水平，促进子宫内膜癌发生及发展。

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（收稿日期：2017-02-14） （本文编辑：周亚杰）endprint