苹果轮纹病菌检测方法及鉴定

摘要 选取苹果轮纹病具有代表性的B. dothidea，成功地设计并且合成了B. dothidea实时荧光 PCR 引物和探针，建立了B. dothidea的实时荧光PCR检测体系。结果表明，利用16S rDNA序列设计的特异性探针能够快速检测、鉴定植物病原B. dothidea，具有灵敏度高、不易污染和漏检的优点。

关键词 苹果轮纹病菌；检测方法；鉴定

中图分类号 S436.611.1+6 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）19-0100-02

苹果轮纹病是一种真菌性病害，病原菌为贝氏葡萄座腔菌梨专化型Botryosphaeria dothidea，可使苹果果实腐烂、枝干树皮疣突及局部坏死。苹果轮纹病在我国发生范围广、危害重，在高温多雨的地区发病尤为严重[1]，常年平均烂果率达20%～30%，多雨年份可达40%～50%，病果率非常高。一般在贮藏期发病，侵染后产生病斑，最后在病斑处形成颜色深浅不一、交替排列的同心轮纹，并在病健交界处有明显间隔，因而得名轮纹病[2]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料。从南京口岸进境旅客携带物中截获的可疑苹果病果上分离所得菌株，包括炭疽病（Colletotrichum gloe-osporioides）、链格孢（Alternaria mali）、间座壳属（Diaporth-aceae sp.）、拟茎点霉（Phomopsas mali）、可可色二孢（Lasiod-iplodia theobromae）、蔷薇盾壳霉（Coniothyrium tirolensis）、奇异根串珠霉（Thielaviopsis paradoxa）、交链孢（Alternaria sp.）、美澳褐腐（Monilinia fructicola）、牛眼果腐（Neofabraea spp.），均由江苏出入境检验检疫局植检所提供。

1.1.2 供试试剂。TIANGEN DP305DNA提取试剂盒。PDA培养基：马铃薯200 g，洗净去皮切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，纱布过滤，再加20 g葡萄糖、20 g琼脂，灭菌水1 000 mL。

1.1.3 供试仪器。实时荧光PCR仪ABIPRISM7500FAST PCR仪（ABI公司）和LightCycler1.5实时荧光定量PCR仪（ABI公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计。收集菌体供试菌株菌丝，用植物基因組 DNA提取试剂盒提取DNA。根据GenBank中苹果轮纹病菌DNA中的保守序列设计1对寡核苷酸引物和TaqMan探针[3]。参照Wiiiam G 等设计16S rDNA通用引物对：

Bd-beta-FP GGCTCTGGCGTGTAAGTCTG

Bd-beta-RP GGTCCGAGGTGCCATTGTA

TaqMan探针Bd-beta-PFAM-TCTCAGCGTGGGAGAA-CATCAATGA-BHQ

1.2.2 实时荧光。实时荧光PCR检测供试的炭疽病（Coll-etotrichum gloeosporioides）、链格孢（Alternaria mali）、间座壳属（Diaporthaceae sp.）、拟茎点霉（Phomopsas mali）、可可色二孢（Lasiodiplodia theobromae）、蔷薇盾壳霉（Coniothyrium tir-olensis）、奇异根串珠霉（Thielaviopsis paradoxa）、交链孢（Alt-ernaria sp.）、美澳褐腐（Monilinia fructicola）、牛眼果腐（Neo-fabraea ）菌株的DNA。

反应体系为20 μL，包括2×Premix Ex Taq10 μL、5 μmol/L上下游引物各0.8 μL、5 μmol/L探针0.2 μL、模板DNA 2 μL、50×ROX Reference DyeⅡ0.4 μL、加无菌水补至20 μL。反应程序为：95 ℃，10 min ；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，共40个循环。

将检测样品在ABIPRISM 7500 FAST上扩增，结束后打开分析软件到找到Ct值，记录下每个样品的Ct值和Ct值分析检测结果。

1.2.3 灵敏度检测。将轮纹病菌菌液（B. dothidea）模板DNA逐级稀释5倍，浓度分别为20.0、4.0、0.8 ng/L和150、50、10 pg/L（BECKMAN紫外分光光度测浓度）。退火温度60 ℃，分别加入实时荧光体系中扩增。

2 结果与分析

2.1 特异性扩增

由图1可知，该探针只对B. dothidea进行了特异性扩增，而对其他菌株没有扩增[3]。

2.2 灵敏度试验

由图2可知，实时荧光PCR可以扩增不同浓度的B.dothidea模板DNA，并且浓度为10 pg/L时仍有扩增。虽然模板浓度与检出率、特异性有一定的线性关系，但并非是成正相关，在模板浓度0.8 ng/L时扩增效率最高。模板浓度太高或太低都会使RCR反应受到干扰，影响扩增效率[3]。

通过已知起始拷贝数的标准品苹果轮纹病（B. dothidea）RT-Realtime定量PCR做出标准曲线，log（起始浓度）与循环数呈线性关系，该扩增反应存在的线性关系（图3）。

3 结论与讨论

葡萄座腔菌属（Botryosphaeria）下面有3个种，分别为B. dothidea、B. malicola和B. obtusa[4-5]。其中，B. dothidea是主要类群，B. malicola和B. obtusa为偶发类群[6]。致病性测定显示B.obtusa也是苹果果实轮纹病的一个新病原，但是在我国尚未发现苹果黑腐病病菌B. obtusa侵染苹果造成苹果轮纹病的报道。本试验的苹果轮纹病选取了具有代表性的B. dothidea，成功地设计并且合成了B. dothidea实时荧光 PCR 引物和探针，建立了B. dothidea的实时荧光PCR检测体系。试验结果表明，利用16S rDNA序列设计的特异性探针能够快速检测、鉴定植物病原B. dothidea，灵敏度高、不易污染和漏检[2-3]，可为快速检测B. dothidea奠定基础。

4 参考文献

[1] 康玲，郝红梅，杨振英，等.苹果轮纹病研究进展[J].中国农学通报，2009（9）：188-191.

[2] 孙鑫垚.陕西省苹果轮纹病病原菌鉴定与多样性研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2010.

[3] 杨秋夏.入境旅客携带苹果传带病原菌的风险分析及部分病原菌检测技术研究[D].南京：南京农业大学，2014.

[4] 肖洲烨，李保华，国立耘.葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）的有性阶段在我国苹果主产区的发生[J].果树学报，2013，30（6）：1005-1010.

[5] 赵增锋，曹克强.苹果轮纹病害流行研究及防控[J].北方园艺，2012（1）：127-129.

[6] 刘保友，王英姿，栾炳辉，等.苹果轮纹病病原菌孢子田间释放监测方法研究[J].中国果树，2011（6）：48-50.endprint