神经营养因子修饰胚胎脊髓神经干细胞移植后脊髓损伤大鼠的功能恢复和损伤局部基因表达

解锦鼎　王龙　杨印东　俞春雷　栗昭生　安宁

[摘要] 目的 探究神经营养因子修饰胚胎脊髓神经干细胞移植后脊髓损伤大鼠的功能恢复与损伤局部基因表达。方法 于2016年8月从孕18 d的30只大鼠胚胎脑部皮质中提取适量的脊髓神经干细胞，对其进行体外培养，然后采用巢蛋白免疫荧光染色方法进行鉴定，将鉴定后的胚胎脊髓神经干细胞植入成年的大鼠损伤脊髓，并将其分为3组，对照组10只、神经干细胞组10只、神经干细胞加胚胎细胞衍生的神经因子移植10只，对胚胎神经干细胞的存活进行观察分析，并对大鼠的损伤后的功能恢复情况以及局部基因表达进行比较分析。结果 经过胚胎神经干细胞移植后，7、21 d大鼠的运动功功能评分分别为（26.37±4.62）分、（39.55±2.42）分，对照组7、21 d的运动功能评分分别为（25.62±2.523）分、（32.43±2.46）分，差异有统计学意义（P<0.05），脊髓損伤局部空洞面积也得到了减小（P<0.05），在胚胎神经干细胞中加入修饰胚胎脊髓的神经营养因子后，大鼠的运动功能恢复与局部损伤基因状况改善更加明显，神经干细胞不仅存活，而且能够向损伤头尾处迁移4 mm。结论 采用神经营养因子修饰胚胎脊髓神经干细胞移植后，不仅能够使神经细胞存活，迁移，而且能促进大鼠功能的有效恢复。

[关键词] 神经营养因子；胚胎脊髓神经干细胞；脊髓损伤；功能恢复

[中图分类号] R446 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）09（b）-0001-03

[Abstract] Objective This paper tries to investigate the functional recovery and damage of local gene expression in rats with spinal cord injury after transplantation of neurotrophic factor-modified embryonic spinal cord neural stem cells. Methods The spinal cord neural stem cells were extracted from the brain cortex of 30 rat embryos for 18 days from August 2016， and then cultured in vitro by nestin immunofluorescence staining. The embryonic spinal cord neural stem cells were implanted into adult rats. The adult rats were divided into three groups： the control group （n=10）， the neural stem cells （n=10）， the neural stem cells （MSCs） and embryonic cells （n=10）. The survival of embryonic neural stem cells was observed and analyzed. And the functional recovery of the rats after injury and the local gene expression were analyzed. Results After embryonic neural stem cells transplantation， the movement function score of rats after 7 days and 21 days were （26.37±4.62）points and （39.55±2.42）points respectively， and the control group in the movement of 7 days and 21 days were （25.62±2.523）points and （32.43±2.46）points respectively， the difference was statistically significant （P<0.05）， local cavity area of spinal cord injury was also decreased（P<0.05）； after adding modifiers in embryonic neural stem cells of embryonic spinal cord after neurotrophic factor， the improvement of rats motor function recovery and partial damage genetic was apparent， not only did the neural stem cells survive， but also damage could migrate 4 mm from the head and tail. Conclusion The use of neurotrophic factor modified embryonic spinal cord neural stem cell transplantation not only can make nerve cell survive and migrate， but also promote effective functional recovery in rats.

[Key words] Neurotrophic factor； Embryonic spinal cord neural stem cells； Spinal cord injury； Functional recoveryendprint

随着我国社会主义现代化建设的不断发展，我国的医疗卫生水平得到了空前地提升。目前，神经干细胞移植得到了国内外医学研究者的普遍关注，它主要致力于对脊髓损伤的治疗，具有一定的发展前景[1]。然而，当前的神经干细胞移植后存在存活率低、疗效不明显等问题，而采用胚胎修饰的神经营养因子能够对脊髓损伤起到恢复作用[2]。该次研究于2016年8月对30只脊髓损伤大鼠的神经营养因子修饰胚胎脊髓神经干细胞移植进行分析，观察脊髓损伤大鼠移植后的功能恢复情况，为临床医学的神经干细胞移植提供一个参考依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

该次研究选取了孕18 d的30只成年雌性wistar大鼠，将这30只大鼠分别分为3组，每组10只，一组为神经干细胞组（NSC组）：重量在240～270 g之间，平均重量为（250±2.4）g，胚龄为13～16 d，平均为（14.6±1.5）d；一组为神经干细胞加神经营养因子修饰（NSCs+GDNF组）：重量在235～270 g，平均为（254±3.2）g，胚龄为12～16 d，平均为（14.1±1.8）d；另一组则为对照组：重量在245～275 g之间，平均重量为（255±2.6）g，胚龄为13～15 d，平均为（14.4±1.6）d。3组大鼠在胚龄、重量等方面差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。在实验之前，先进行模型制作，采用2%的戊巴比妥钠腹腔麻醉术对大鼠进行麻醉，然后将动物的皮肤打开，对其进行肌肉分离，使动物的脊椎暴露，用医学动脉夹对动物的脊髓持续5 s左右的夹击，并用生理盐水对动物的伤口进行冲洗，再将皮肤缝合，辅之以青霉素注射。饲养条件、饲料情况、护理条件均符合国际上拟定的动物公约[3]。

1.2 方法

首先从孕18 d的大鼠胚胎中提取大脑皮质，并通过吹打使其成为单个分开的细胞，将这些细胞收集起来，1.5×105个/瓶，无血清培养基培养、2%N2以及5 μg/mL肝素要进行定时更换，以2次/周为宜，另外，要适当增补FGF-2以及EGF，并对神经球进行免疫鉴定。首先采用4%的多聚甲醛对神经球进行固定，一般固定30 min即可，将30%的蔗糖经过夜且为厚度在15 μm左右的切片，选用pH为7.4的洗涤液，封闭液则是由10%洗涤液与山羊血清组成，在37℃温度下封闭1 h左右，然后去除封闭，施以nestin单抗5℃过夜，对对照组则加PBS，在次日进行湿盒内37℃避光孵育，大概在45 min左右[4]。然后于载波片滴加适量的混合液，对其封闭，采用荧光镜进行观察，并将所拍摄图片进行记录。在进行移植前，对已鉴定过的前体细胞加以Hochest原液，在37℃的温度下，用5%的二氧化碳进行1 h的孵育，再用培养液进行反复冲洗，将细胞重悬，并将其浓度进行调整，以1×104个细胞/U，将其置于冰中，做好移植前的准备。对照组在移植神经干细胞时不包含营养因子，经神经干细胞加胚胎细胞衍生的神经因子组加入修饰胚胎脊髓神经因子。在移植的过程中要使动物的损伤脊髓充分暴露在视线内，采用立体定位仪实现微玻管的固定，并在动物的脊髓损伤处注射细胞，然后立即对伤口处进行缝合，并注射抗菌药物等，观察动物的变化情况，待其醒后，移到动物房进行有效护理。

1.3 观察指标

在实验后1个月左右，对大鼠进行斜板实验以及运动功能评分，主要观察动物的臀、膝、踝关节等，观察动物的协调功能，并采用BBB运动评分对其进行比较分析[4]。

1.4 统计方法

该次研究用SPSS 15.0统计学软件进行数据的统计与分析，所用的计数资料采用[n（%）]表示，用χ2来进行检验，用平均数±标准差（x±s）的形式表示计量资料，行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 斜板实验

在实验后的2周左右，对实验大鼠进行斜板实验，移植术均符合模型的基本要求。在实验4周后，这3组大鼠的实验结果分别为：神经干细胞组（35.63±0.52）分，神经干细胞加修饰胚胎脊髓神经营养因子组为（39.55±2.42）分，对照组则为（32.43±2.46）分，神经干细胞组与另外两组差异有统计学意义，且与神经干细胞加修饰胚胎脊髓神经营养因子组差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 功能恢复评分测试

经过平地场测试，对照组、神经干细胞组以及经干细胞加修饰胚胎脊髓神经营养因子组的大鼠的得分依次为（5.12±0.45）分、（6.95±0.53）分、（8.73±0.24）分，经干细胞加修饰胚胎脊髓神经营养因子组的分值最高，与其他两组差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

3 讨论

近年来，神经干细胞移植在临床医学中得到了广泛地应用。目前已经研究出在胚胎、成年人的大脑与脊髓中都含有大量的胚胎神经干细胞，它具有一定的特殊性，可以用于对神经性疾病的有效治疗[5-6]。该次实验中选用的都是大鼠的胚胎神经干细胞，在对干细胞进行培养的过程中可以发现胚胎神经细胞具有一定的活性，且不容易分化，有一定的优越性。该次研究采用动脉夹击法创建了脊髓损伤的模型，这在一定程度上与临床中的脊髓损伤者相似性，在对大鼠进行细胞移植的1个月后，可以发现神经干细胞组能得到了存活，大鼠的运动功功能评分达到（39.55±2.42）分与对照组的（32.43±2.46）分差异有统计学意义（P<0.05），脊髓损伤局部空洞面积也得到了减小（P<0.05），在胚胎神经干细胞中加入修饰胚胎脊髓的神经营养因子后，大鼠的运动功能恢复与局部损伤基因状况改善更加明显，神经干细胞不仅存活，而且能够向损伤头尾处迁移4 mm，这很大程度上源于所移植的细胞向神经原、星型细胞转化，为轴突的再生提供必不可少的生长基质。学者Shan Gao等人[7]在研究NSCs移植修复大鼠SCI中发现，NSCs在移植前处于克隆球阶段能够特异性的分泌神经营养因子，在移植后亦通过ELISA免疫组织化学方法证实NSCs能持续上调包括GDNF在内的多种神经营养因子的表达，由移植前的（2.43±1.36）分增高至（8.78±1.62）分，与该次研究结果一致。

综上所述，神经营养因子修饰胚胎脊髓神经干细胞移植后脊髓损伤大鼠的功能恢复与损伤局部基因表达有着明显的效果，能够促进大鼠运动功能的恢复，可以为临床医学提供一个有效的参考。

[参考文献]

[1] 刘志刚，熊敏，曾云，等.脑源性神经营养因子基因修饰脂肪间充质干细胞移植对急性脊髓损伤大鼠运动功能的恢复作用[J].湖北醫药学院学报，2012（5）：351-354.

[2] 汪雷，宋跃明，刘立岷，等.NEP1-40基因修饰的神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠行为学恢复的影响[J]. 华西医学，2014（11）：2006-2011.

[3] 董锋，林建华，吴朝阳. 骨髓间充质干细胞尾静脉移植脊髓损伤大鼠脑源性神经营养因子及神经生长因子的表达[J]. 中国组织工程研究与临床康复，2011（27）：5026-5030.

[4] 孙立新，金晓明，汪海波.低氧条件下骨髓间充质干细胞营养因子表达的改变[J].牡丹江医学院学报，2011，32（1）：11-13.

[5] 邸红岩， 黎爱芬， 赵受伟. 鼠神经生长因子对急性脑梗死患者神经功能康复的临床疗效观察[J].牡丹江医学院学报，2014（35）：20-21.

[6] 孔令胜， 姚维成， 栗世方，等. 基因修饰神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经营养素养-3表达及神经细胞凋亡的影响[J]. 济宁医学院学报， 2014（6）：393-398.

[7] Shan Gao，Jie Ding，Hai-Jun Xiao，et al.Anti-inflammatory and Anti-apoptotic Effect of Combined Treatment with Methylprednisolone and Amniotic Membrane Mesenchymal Stem Cells After Spinal Cord Injury in Rats[J]. Neurochemical Research，2014，39（8）：1544.

（收稿日期：2017-06-12）endprint