嗜蓝孢孔菌属(Fomitiporia)一新种

郭 尚，周 林，徐莉娜，李艳婷，南晓洁

(山西省农业科学院食用菌研究所，山西 太原 030031)

嗜蓝孢孔菌属(Fomitiporia)一新种

郭 尚，周 林*，徐莉娜，李艳婷，南晓洁

(山西省农业科学院食用菌研究所，山西 太原 030031)

【目的】在山西雁北地区沙棘树腐木上采集到了野生嗜蓝孢孔菌属一新菌，研究其新菌的形态学特征、分子系统发育并确定新种。【方法】形态学观察采用肉眼观察标本以及制作Melzer、棉蓝和5 % KOH 3种试剂的浮载切片，在显微镜下观察标本形态，分子系统发育分析采用将新种的ITS序列与其他已经报道的20种真菌ITS进行同源聚类分析，构建基于ITS的分子系统发育树。【结果】形态学特征为具有马蹄形担子果，盖状无柄，有时平伏反卷生长，单系菌丝系统；骨架菌丝在Melzer试剂和棉蓝试剂中呈负反应；担孢子近球形或球形，无色，厚壁等。分子系统发育分析结果表明新种与嗜蓝孢孔菌属亲缘关系较近，聚在一个分支中，并在系统发育树中形成了一个独立的亚分枝。【结论】根据研究确认为嗜蓝孢孔菌属新种，定名为FomitiporiayanbeiensisS. Guo & L. Zhou(登陆号GenBank: KT861405, Fungal name: FN570360)。

嗜蓝孢孔菌；新种；形态学；分子系统发育树；分类

【研究意义】嗜蓝孢孔菌属真菌是一类非常重要的药用真菌，含有三萜类化合物、葡聚糖、黄酮等多种健康有益的功能成分，对人类健康保健品的开发，具有很重要的价值。【前人研究进展】以前有些人将这类真菌与桑黄属的Phellinuspunctatus-robustus的复合体混为一类相似体[1]，但是近年来的研究认为，这两个种类属于不同的属，在分子系统发育研究中形成了明显的、单系的分支[2]。在分类学研究中，近年来分子生物学技术应用于传统的分类学研究中，使之产生了巨大的进步，嗜蓝孢孔菌属Fomitiporia的分类也随之发展，报道了一些新种[3-5]。【本研究切入点】2015年秋，在山西雁北地区的野生沙棘树腐木上采到了一株野生嗜蓝孢孔菌。从子实体形态和显微镜下的观察结果，以及分子ITS测序分析结果认为，该菌具有明显的嗜蓝孢孔菌Fomitiporia属的特征，在分子系统发育树中形成单独的分支，因此确认该菌为Fomitiporia属的1个新种，定名为FomitiporiayanbeiensisS. Guo & L. Zhou。【拟解决的关键问题】现将FomitiporiayanbeiensisS. Guo & L. Zhou的形态学特征、分子生物学特征和系统发育情况报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本和菌株

2015年10月，著者们在山西雁北地区采集到了一株野生嗜蓝孢孔菌属真菌，此菌株生长在沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)腐木上，采集地点海拔1352 m，北纬39°98′、东经112°47′，采集标本(SXSYJBB1510)，以及用新鲜子实体分离得到纯菌株(SXSYJJZ No.1510)，保存于山西省农科院食用菌所内。同时送中国农科院微生物菌种保藏中心收藏(CGMCC No.13380)。

1.2 获得纯菌种

培养基为常规的PDA培养基，pH 6。采用组织分离法，将子实体表面消毒(高锰酸钾或乙醇)，无菌操作切取子实体内部菌肉，接于灭菌后的PDA培养基试管中，培养条件为27 ℃，黑暗。

1.3 形态学鉴别

以裸眼确认标本，鉴别真菌标本的色、形、质、边缘、菌盖、菌柄、以及纹饰，毛刺有无等特征，记录菌体大小、轮廓长、宽度等。

标本显微特征鉴别，以Melzer试剂制作切片观察菌丝系统的淀粉质反应或拟糊精反应，在5 % KOH试剂中观察菌丝系统的变化反应、菌髓或菌肉菌丝的排列方式等。在棉蓝切片中观察菌丝的嗜蓝反应，同时观察生殖菌丝、骨架菌丝、囊状体或拟囊状体以及其他结构等在棉蓝试剂和Melzer试剂中的反应。

资料对比判断，根据标本的特征以及采集地的生态环境，查阅相关资料对比鉴别[6]。

1.4 分子生物学分析

采集的嗜蓝孢孔菌新菌株培养用PDA培养基，DNA提取用CTAB法，检测纯度和完整性用微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳。引物用ITS5，对提取的ITS DNA进行PCR扩增，PCR反应，变性(95 ℃预变性2 min)-复性(57 ℃复性1 min)-延伸(72 ℃延伸1 min)等3个过程35个循环，最后保温10 min(72 ℃)。

1.5 系统发育树的研究

从GenBank中收集嗜蓝孢孔菌属Fomitiporia21个标本和14个物种的参考序列(表1)构建系统发育树，软件ClustalX2.0.11进行默认程序的核苷酸序列自动比对，序列对齐，进一步优化和手工调整，构建基于ITS的系统发育树。相同寄主的种FomitiporiahippophaeicolaMUCL 31746和FomitiporiahippophaeicolaMUCL31747两个菌株选作外群。进化分枝上Bootstrap检验度为1000，Values大于50 %。

表1 用于系统发育树分析的相关菌株及ITS序列登录号

续表1 Continued table 1

属/种名Genus/speciesnamesVoucher地点LocalityGenBank登录号GenBankAccessionNo.作者AuthorsFomitiporiaerectaMUCL49871FranceGU461939A.David.FomitiporiagabonensisMUCL47576(T)GabonGU461971Amalfi&DecockFomitiporiasp.GL-2016ChinaKT861405FomitiporiahippophaeicolaMUCL31746BelgiumGU461945Fiasson&NiemelaMUCL31747BelgiumGU461946Fiasson&NiemelaFomitiporiapunctateMUCL34101GermanyAY618200Murrill.MUCL47629JapanGU461982Murrill.MUCL53548EuropeJX093834Murrill.FomitiporiarobustaMUCL51297EstoniaJQ087892Fiasson&NiemelaMUCL51327CzechGU461949Fiasson&NiemelaFomitiporiasp.MUCL53009SouthAfricaJQ087890Amalfi.FomitiporiatenuisMUCL49948GabonGU461958Decock.FomitiporiatorreyaeMUCL47628JapanJQ087896Y.C.Dai&B.K.CuiFomitiporiaPS3MUCL52350MexicoJQ087885Amalfi.

2 结果与分析

2.1 形态特征描述

子实体：担子果多年生，干燥的子实体呈木质状，无柄，盖状，马蹄形，单生，平伏有时反卷生长，无异味，木栓化。单片菌盖长径大约5～7 cm，宽径2～4 cm宽，厚度1～2 cm。菌盖上表面棕褐色，粗糙，无同心环带，菌盖下表面呈绿褐色，木栓质，具同心的环区。菌盖边缘钝化，黄褐色，菌肉也呈黄褐色，达30 mm厚。菌管比菌肉颜色稍暗，呈棕黄色，木质 (图1)。

菌丝结构：单系菌丝系统，生殖菌丝有锁状联合。在Melzer试剂和棉蓝试剂中骨架菌丝呈负反应，在氢氧化钾试剂中无反应，菌丝即不消解，也不膨胀。

新种 A～C:沙棘树上的子实体；Bar=5cmA-C: Habit on Seabuckthorn trees; Bar=5cm图1 嗜蓝孢孔菌 Fig.1 Fomitiporia yanbeiensis

菌肉：生殖菌丝为无色或浅黄色，数量较少，壁较薄或稍厚，偶有分枝，直径约1.4～2.5 μm。骨架菌丝较多，呈黄褐色至锈褐色，厚壁，有一内腔，有分枝无分隔，交织排列，直径为1.7～3.2 μm。

菌管: 生殖菌丝较少，无色，薄壁，偶尔分枝，直径为2.0～3.0 μm；多数为呈黄褐色的骨架菌丝，大致沿菌平行排列，壁较厚，直径为2.5～4.8 μm。

孢子: 担孢子球形或近球形，平滑，无色。壁很厚，Melzer中呈淀粉反应，在棉蓝中无嗜蓝反应。大小为 4.0～5.1 μm×5.4～6.1 μm，平均长为4.52 μm，平均宽为4.18 μm，长宽比约为1.08。子实层中有囊状体，无刚毛，壁薄，大小约为4.6～8.0 μm×3.8～4.0 μm；担子桶状不着生担孢子梗，大小约为 6.0～12.0 μm×4.0～6.5 μm。拟担子很少，与担子的形状有些相似，但与担子相比略小一些。

模式标本存放在山西省农科院食用菌研究所(SXSYJBB1510)。寄主为沙棘树。采集地位山西省的雁北地区，北纬39°98′、东经112°47′，海拔1352 m。

2.2 DNA测序鉴定

所提取的Fomitiporiayanbeiensis基因组用微量分光光度计检测后，结果显示其OD260/280=1.68，OD260/230=1213，浓度为47.2 ng/μl，表明所提取的基因组质量高、纯度好，符合下游PCR的要求。以提取的Fomitiporiayanbeiensis基因组为模板，ITS DNA的扩增结果见图2。

Sanger测序结果上传NCBI 检索得到登录号：KT861405.1，并将此序列Blast同源比对，结果显示出新菌标本ITS DNA与嗜蓝孢孔菌属的一些种类具有极高的同源性。

2.3 分子系统发育分析

从GenBank中经Blast检索后，下载相似性大于90 %的相关菌株的ITS1-5.8S-ITS2区段序列，用ClustalX2.0.11软件对菌株Fomitiporiayanbeiensis和下载的序列进行比对，用Mega5软件，以FomitiporiahippophaeicolaMUCL 31747为外群，构建邻接(NJ)系统发育树(图3)。本研究菌株Fomitiporiayanbeiensis和嗜蓝孢孔菌属Fomitiporia的一些种以100 %的支持率聚在同一分支中。系统发育树表明，菌株Fomitiporiayanbeiensis的系统发育地位属于嗜蓝孢孔菌属。基于形态特征与其嗜蓝孢孔菌属种的比较结果，以及分子系统发育分析，支持菌株Fomitiporiayanbeiensis是嗜蓝孢孔菌属中的一个新分类单元。

图2 ITS PCR产物凝胶电泳结果Fig.2 Gel electrophoresis results of ITS PCR products.

3 讨 论

根据资料记载，嗜蓝孢孔菌属Fomitiporia真菌有37个种被研究报道过[7]，是锈革孔菌科中的一个独立的类群[8]，目前在中国报道过的种类有13个种[4]。我们的新菌标本具有嗜蓝孢孔菌属真菌种类Fomitiporiagenus的代表特性，因此可以确认Fomitiporiayanbeiensis是Fomitiporia属的一个种类。

近年来应用DNA条码技术研究生物分类，为微生物特别是真菌分类提供了一个确切可靠的鉴定手段，ITS序列分析被视为微生物种类鉴定的简便有效的方法之一[9-10]。在本研究中，获得Fomitiporiayanbeiensis了长度为789 bp的ITS序列片段，经在GenBank中的Blast检索比对，与嗜蓝孢孔菌属真菌种类Fomitiporiagenus的代表菌株亲缘关系较近11]，相似性为95 %～96 %。而与其他的Fomitiporiasp.都亲缘较远，相似性91 %以下。与具有相同寄主的Fomitiporiahippopha⊇icola(H. Jahn) Fiasson & Niemelä[11-12]的序列相似度只有88 %[13]，这意味着两个种类应该不属于同种。

在系统发育树中，Fomitiporiayanbeiensis内嵌于Fomitiporiasp.进化枝中，形成了明显的、支持率高的、单独的分枝。Fomitiporiasp.在中国已经有很多报道， Dai YC等[3,14]发表的新种中，FomitiporiabannaensisY.C. Dai和FomitiporiatorreyaeY.C. Dai & B.K. Cui，在系统发育树中与FomitiporiayanbeiensisS. Guo & L. Zhou相距较远，这可能说明这些种类与本研究报道的Fomitiporiayanbeiensissp.nov.具有较远的亲缘关系(图3)。

在我国报道过的木生真菌大约有百十余种，南方的广西、云南以及东北地区较多，锈革孔菌科的很多木生真菌种类都是树木的病原菌，侵染活树使树体罹病，造成树木腐烂甚至死亡[15]。在山西雁北地区发现的此新菌是野生状态的，采集地实地考察以及访问当地居民，没有关于沙棘林因为生长有这种新菌而造成树木死亡的说法，当地居民们说这是在沙棘树死后才长出来的。笔者们是在沙棘树的腐木上采集到的这种菌株，没有在活树上发现，可能是我们采集到的菌株是多年生标本，树木已经死亡。再就是可能调查范围有限，未能发现活体树上的标本，今后我们将继续调查采集，扩大采集地区、采集树的树龄以及生长季节。同时也在进行新菌的菌种培养基质研究和人工栽培驯化试验，利用小麦、小米、玉米等培养基质接种，大约30～45 d即可培养出健壮的菌丝[16]，在野外活体沙棘树上或断木上做接种实验，研究这个新菌(Fomitiporiayanbeiensis)在活体沙棘树上以及其他树种上能否生长，是否使树体罹病，能否进行人工驯化，为实现仿野生栽培和人工栽培提供一些基本实验依据。

分支树上的数据表示Bootstrap检验的支持百分率，显示菌株的GenBank序列号，标尺参数表示进化距离The confidence values of 50 or above from 1000 replicate bootstrap sampling are shown at each node, GenBank accession numbers are shown.Bars=distance corresponding to 10 base changes per 100图3 依据ITS区序列构建的嗜蓝孢孔菌属及相关类群系统发育树Fig.3 Molecular phylogenetic tree inferred from the rDNA-ITS sequence of Fomitiporia (obtained from this study) and related strains (obtained from GenBank)nucleotide positions.

4 结 论

分析鉴定确认，该研究标本嗜蓝孢孔菌属新种(Fomitiporiayanbeiensis) 具有Fomitiporiagenus的代表特性，如子实体、菌丝体、担孢子等特征，属于Fomitiporia属种类，是嗜蓝孢孔菌属的一个新种，定名为FomitiporiayanbeiensisS. Guo & L. Zhou(登陆号GenBank: KT861405, Fungal name: FN570360)，与Fomitiporiahippopha⊇icola具有相同的沙棘分离源，但从形态学特征和ITS分子序列分析结果看，不属于相同种类。

[1]Fischer M. On the species complexes within Phellinus:Fomitiporiarevisited[J]. Mycological Research, 1996, 100:1459-1467.

[2]Decock C, Bitew A, Castillo G.FomitiporiatenuisandFomitiporiaaethiopica(Basidiomycetes, Hymenochaetales), two undescribed species from the Ethiopian highlands: taxonomy and phylogeny[J]. Mycologia, 2005，97(1): 121-129.

[3]戴玉成，徐梅卿，吴兴亮. 中国亚热带地区阔叶树上一种新的立木腐朽病[J]. 林业科学研究，2001，14(1): 47-49.

[4]戴玉成.中国多孔菌名录[J].菌物学报,2009, 28(3): 315-327.

[5]崔宝凯, 孙向前, 陈建新, 等. 浙江天目山两种新的阔叶树心材腐朽病[J]. 林业科学研究,2007,20(1): 97-100.

[6]张晓青,戴玉成. 中国真菌志—锈革孔菌科 [M].北京: 科学出版社, 2005.

[7]Wikipedia. Fomitiporia[EB/OL].https//en.wikipedia.org/wiki, 2016, on 26 November.

[8]昝立峰. 粗毛纤孔菌与椭圆嗜蓝孢孔菌子实体的化学成分及其药理活性研究[D]. 长春:吉林农业大学, 2012.

[9]林惠娇，蒋 湘，王新国，等.DNA条形码技术及其在真菌研究中的应用[J]. 植物检疫， 2013，27(2):11-18.

[10]王寿南，陈青君，张国庆，等. 一株野生桑黄的分离鉴定与生物学特性[J]. 应用与环境生物学报，2016,22(40): 667-674.

[11]Si J, Dai Y C. Wood-decaying fungi in eastern Himalayas 5. Polypore diversity[J]. Mycosystema, 2016,35(3): 252-278.

[12]李 玉，李泰辉. 中国大型菌物资源图鉴[M]. 郑州:中原农民出版社，2015:381-390.

[13]National Center for Biotechnology Information(NCBI)https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.

[14]Dai Y C, Zhang M.Fomotiporiatibetica, a new species of Hymenochaetaceae(Basidiomycota) from China [J]. Mycotaxon, 2002, 83: 217-222.

[15]崔宝凯,杜 萍,陶万强,等. 北京地区黄栌和桑树上的新病原腐朽菌[J].林业科学研究，2009, 22(2):274-278.

[16]郭 尚,周 林,徐莉娜，等. 一个嗜蓝孢孔菌属新菌株的分离、鉴定与菌种培养基质研究[J].安徽农学通报，2017，23(14):35-37.

ANewSpeciesofGenusFomitiporia

GUO Shang，ZHOU Lin*，XU Li-na，LI Yan-ting，NAN Xiao-jie

(Shanxi Provincial Academy of Agricultural Sciences, Institute of Edible Fungi, Shanxi Taiyuan 030031, China)

【Objiective】A newFomitiporiafungus,Fomitiporiasp. nov., was collected from the Yanbei area Shanxi province China in the wild buckthorn trees rot wood. The purpose of this study was to identify the morphological characteristics, molecular phylogeny and new species of new strain. 【Methods】Morphological observation was carried out by naked eye observation, and under the Nikon E80i microscope, 3 kinds of reagents, Melzer, cotton blue and 5 % KOH, were used as slides to observe the microscopic shape,Molecular phylogenetic analysis was carried out by homologous clustering analysis of the new ITS sequences with 20 other reported fungal ITS, and a phylogenetic tree based on ITS was constructed. 【Result】The morphological feature was that it has a horseshoe shaped cover basidiocarps, sessile, sometimes procumbent backscroll mycelium growth, single system; skeletal hyphae showed a negative reaction in the Melzer reagent and cotton blue reagent; basidiospore near spherical or spherical, colorless, thick wall etc. Molecular phylogenetic analysis showed that the new species had close relationship with the genus Cladosporium and clustered into one branch and formed an independent sub clade in the phylogenetic tree. 【Conclusion 】According to the study, it was confirmed as a new species ofFomitiporiagenus and namedFomitiporiayanbeiensisS. Guo & L. Zhou (GenBank: KT861405, Fungal name: FN570360). The type specimen SXSYJBB1510 was stored in the Institute of edible fungi of Shanxi Academy of Agricultural Sciences, and the strain specimen CGMCC No.13380 has been deposited in China General Microbiological Culture Collection Center.

Fomitiporia; New species; Morphology; Phylogenetic trees; Classification

1001-4829(2017)10-2334-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.029

2017-04-27

山西省煤基重点科技攻关(FT2014-03)

郭 尚(1967-)，男，山西阳高人，博士，副研究员，主要从事食用菌菌根共生机理、食(药)用菌生产技术与种质资源研究，E-mail:gs0351@sohu.com,*为通讯作者，E-mail: nkysyj301@126.com。

S567.3+4

A

(责任编辑 李 洁)