3种海洋鱼油脂肪酸组成及其位置分布

张惠君 - 王兴国 - 金青哲 -

(1. 江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2. 江南大学国家功能食品工程技术研究中心，江苏 无锡 214122；3. 江南大学江苏省食品安全与质量控制协同创新中心，江苏 无锡 214122;4. 江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122) (1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China; 2. National EngineeringResearch Center for Functional Food, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China; 3. Collaborative InnovationCenter of Food Safety and Quality Control in Jiangsu Province, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China; 4. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China)

3种海洋鱼油脂肪酸组成及其位置分布

张惠君1,2,3,4ZHANGHui-jun1,2,3,4王兴国1,2,3,4WANGXing-guo1,2,3,4金青哲1,2,3,4JINQin-zhe1,2,3,4

(1. 江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2. 江南大学国家功能食品工程技术研究中心，江苏 无锡 214122；3. 江南大学江苏省食品安全与质量控制协同创新中心，江苏 无锡 214122;4. 江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122) (1.SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China; 2.NationalEngineering
ResearchCenterforFunctionalFood,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China; 3.CollaborativeInnovationCenterofFoodSafetyandQualityControlinJiangsuProvince,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China; 4.StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China)

采用米黑根毛霉源固定化脂肪酶(Lipozyme RM IM)对常见的海洋鱼油甘三脂进行水解，分析了凤尾鱼、金枪鱼、三文鱼甘三酯中脂肪酸的组成及位置分布。采用硅胶色谱柱分离3种海洋鱼油甘三脂，利用Lipozyme RM IM的sn-1,3特异性，将酯化在sn-1,3位上的脂肪酸(EFA)水解成游离脂肪酸(FFA)，然后通过薄层层析(TLC)分离得到sn-2-单甘酯，再甲酯化后利用气相色谱(GC)测定sn-2位脂肪酸组成，并按照脂肪酸的不饱和程度和n-3,6-多不饱和脂肪酸归类分析海洋鱼油甘三酯中各类脂肪酸位置分布的特点。结果表明：3种海洋鱼油(凤尾鱼油、金枪鱼油、三文鱼油)中不饱和脂肪酸含量达到60%以上，其中单不饱和脂肪酸(MUFA)占24.67%～33.51%，多不饱和脂肪酸(PUFA)占26.89%～36.15%，而且一半以上PUFA分布在sn-2位，有利于其吸收和提高其耐氧化性；而SFA和MUFA倾向于分布在sn-1,3位上。n-3与n-6 PUFAs之间的比例均>10，均符合FAO/WHO推荐摄入的标准(>4)，是理想的n-3 PUFA天然营养补充剂。

甘三酯；米黑根毛霉源固定化脂肪酶；sn-2-单甘酯；薄层层析；气相色谱

n-3型多不饱和脂肪酸在人体中具有许多特殊的生理功能。其中，DHA是大脑和视网膜的重要构成成分，在人体大脑皮层中含量高达20%，在视网膜中所占比例最大，约占50%，与ARA共同作用维持大脑和眼睛正常生理功能，促进胎、婴幼儿大脑和视力发育，预防老年痴呆[1-2]；EPA具有抑制血栓，预防心肌梗塞和脑梗塞，治疗动脉粥样硬化和辅助降血压的功效[3-4]；另外，EPA和DHA还具有抗癌、消炎及免疫调节等作用[5-6]。

海洋鱼类是n-3多不饱和脂肪酸的主要食物来源[7]。海洋鱼油由95%以上的甘三酯组成，是构成中性脂的主要组分，如图 1 所示，其由1分子的甘油和3分子的脂肪酸分别酯化在甘油骨架的3个位置上生成的，酰基可位于sn-2 和sn-1,3。

图1 甘三酯结构示意图Figure 1 The structure of triacylglycerol

研究[8-9]表明，脂肪酸在甘三酯中的位置分布决定其消化吸收及氧化稳定性。一方面，sn-2位的脂肪酸更利于人体的消化吸收。Christensen等[8]采用灌胃SD大鼠，考察sn-2-EPA+DHA和sn-1,3-EPA+DHA 2种结构类型M-n-3-M和n-3-M-n-3结构脂消化吸收效率，试验发现：摄取sn-2-EPA+DHA型甘三酯比sn-1,3-EPA+DHA型甘三酯在淋巴转运过程中具有更高的DHA积累量，说明位于sn-2位的EPA和DHA更容易被吸收利用，具有更高的营养和功效价值。另一方面，sn-2位脂肪酸的氧化稳定性更高。Wijesundera等[9]采用加速氧化法和顶空微萃取的方法，分析PPD和PDP，OOD和ODO两组DHA分别位于sn-2位和sn-1,3位的结构甘三酯的丙醛、反式二烯醛等二级氧化指标及过氧化值(PV)，结果发现：PPD和OOD比PDP和ODO更快产生以上二级氧化产物，过氧化值更高，说明位于sn-1,3 的DHA比sn-2位的DHA更易被氧化。所以，准确分析n-3 PUFA在甘三脂中的位置分布是评价其营养价值的重要指标。

常用的测定甘三脂sn-2位脂肪酸组成的方法主要有两类：① 脂肪酶水解法，以胰脂酶为代表[10]；② 格氏降解法，以烯丙基溴化镁为代表。然而，胰脂酶无法有效水解含有LC-PUFA的甘三酯，同时其活性受到反应条件的影响而不稳定；烯丙基溴化镁是一种遇水极易失活的化学催化剂，同时反应过程中涉及到有毒试剂的使用，不利于环境友好。米黑根毛霉源固定化脂肪酶(Lipozyme RM IM)是一种来源于微生物发酵分泌的sn-1,3特异性非常强的脂肪酶，经过固定化之后其性质很稳定[11]。因此，本试验选取Lipozyme RM IM对3种深海鱼油(凤尾鱼、金枪鱼、三文鱼)甘三酯作用，将sn-1,3位上酯化的脂肪酸水解成游离脂肪酸(FFA)，通过薄层层析(TLC)分离得到sn-2-单甘酯，甲酯化后利用气相色谱(GC)对脂肪酸进行测定，从而得到脂肪酸在甘三酯中的位置分布情况。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与方法

凤尾鱼油、金枪鱼油、三文鱼油：丰益油脂化学(上海)有限公司；

米黑根毛霉源固定化脂肪酶(Lipozyme RM IM)：诺维信(中国)生物技术有限公司；

40种脂肪酸甲酯标品：美国Sigma-Aldrich公司；

硅胶及硅胶板：上海上邦生物科技有限公司；

正己烷、盐酸、BF3-乙醚、甲醇、无水硫酸钠、氯化钠、氢氧化钾、硝酸银等：均为分析纯。

1.1.2 主要仪器与设备

气相色谱仪：GC-7820A型，安捷伦科技有限公司；

电子天平：AR2140型，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；

微型旋涡混合仪：XW-80A型，上海沪西分析仪器厂；

磁力搅拌器：DF-101S型，上海沪西分析仪器厂；

数显恒温水浴锅：HH-2型，壇市精选仪器制造厂；

台式离心机：TGL-16G型，上海安亭科学仪器厂；

pH计：Delta 320s 型，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 甘三酯的分离制备 参照袁小武等[12]的方法，采用硅胶柱色谱分离鱼油甘三酯。洗脱液为石油醚(沸程 30～60 ℃)+乙醚(体积比87∶13)。称取油脂样品约 2.5 g，转移至 50 mL 容量瓶中，用洗脱液定容。取层析柱(2 cm×30 cm)，在底部放少许玻璃棉，加入洗脱液和硅胶装柱。吸取油脂样品 20 mL，沿柱壁缓缓加到层析柱上，然后用 250 mL 洗脱液洗脱，速度约为 2 mL/min，洗脱完毕，收集物即为甘油三酯。

1.2.2 米黑根毛霉菌产脂肪酶水解甘三酯 于具塞试管中加入 0.2 mol/L Tris 缓冲液(pH=8.0) 1 mL，甘油三酯 30 mg，混合均匀，40 ℃水浴 1 min，再加入Lipozyme RM IM脂肪酶 8 mg，混合均匀，置于恒温摇床中继续反应 30 min。然后向体系中加入1 mL 6 mol/L的盐酸和2 mL乙醚，震荡离心。取出乙醚层，并用无水Na2SO4进行脱水处理，然后用氮气将其浓缩至200 μL。

1.2.3 酶解产物的分析及sn-2-MAG的提取 将酶解产物上样至薄板，并用正己烷+乙醚+乙酸(体积比50∶50∶1)的扩展液分离获得sn-2-MAG。

1.2.4 脂肪酸组成分析 参照慕鸿雁等[13]的方法，采用三氟化硼法测定鱼油及其水解物中脂肪酸的组成及含量。量取50 μL鱼油，加入1 mL体积比1∶3(BF3: CH3OH)的三氟化硼—甲醇溶液，70 ℃反应3 min，加入1 mL正己烷和饱和NaCl溶液提取，上层液于5 000 r/min离心5 min，过膜以备分析。 GC-FID气相氢火焰离子色谱条件：TR-FAME毛细管色谱柱(60 m×0.32 mm×0.25 μm)；载气N2(纯度 99.999%)；燃烧气H2(纯度99.999%)和空气；H2压力60 kPa；空气压力50 kPa；柱前压220 kPa；进样口温度250 ℃；检测器温度250 ℃；进样量1.0 μL；分流比100∶1；采用程序升温模式，80 ℃保持2 min，5 ℃/min 升温至220 ℃ 并保持40 min。

1.2.5sn-2位脂肪酸组成分析及其比例计算

(1)

式中：

R——sn-2位脂肪酸占总脂肪酸的比例，%；

n1——sn-2位脂肪酸的摩尔百分比，%；

n2——脂肪酸的摩尔百分比，%。

2 结果与分析

2.1 鱼油甘三酯总脂肪酸组成分析

由表1可知，海洋鱼油的脂肪酸组成相对比较复杂，主要有肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、棕榈油酸(C16:1)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、SDA(C18:4)、EPA(C20:5)和DHA(C22:6)。3种海洋鱼油中不仅富含n-3 PUFA，同时含有很高的MUFA，尤其是油酸和棕榈油酸(C16:1)。

表1 3种鱼油中总脂肪酸的组成†Table 1 Total fatty acid compositions of anchovy, tuna, salmon oils %

† 采用摩尔百分比表示脂肪酸含量；同行不同字母表示差异显著，P<0.05。

脂肪酸依据是否含有双键可以分为两类：饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，其中，不饱和脂肪酸又可分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。由图2可知，饱和脂肪酸(SFA)占30%～50%，不饱和脂肪酸(UFA)占50%～70%，其中，单不饱和脂肪酸(MUFA)含量20%～50%，多不饱和脂肪酸(PUFA)含量高达25%～35%，尤其是EPA和DHA的含量高达20%，成为多不饱和脂肪酸的主要组分。因此，深海鱼成为人们日常膳食中EPA和DHA的主要来源。对于饱和脂肪酸，含量最为丰富的是C16:0，3种鱼油都达到10% 以上，其中，凤尾鱼中高达29.85%；单不饱和脂肪酸中C18:1的含量最多，其中，三文鱼中高达27.94%；多不饱和脂肪酸中以EPA和DHA为主，其中，EPA含量最多的是三文鱼14.43%，金枪鱼中DHA含量最多18.76%。 EPA和DHA在3种海鱼中的含量均符合《食品法典标准》(2011修订版)[14]推荐要求，是理想的EPA和DHA添加源。

值得一提的是，3种深海鱼油中丰富的单不饱和脂肪酸可以起到降血糖，调节血脂，降胆固醇的功效。油酸(C18:1)降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的效果与亚油酸等多不饱和脂肪酸相当[15]。高密度脂蛋白胆固醇与血清总胆固醇的比值与单不饱和脂防酸呈正相关[16]，减少膳食胆固醇和饱和脂肪酸摄入、适当增加单不饱和脂肪酸的摄入能有效减少高胆固醇血症及心血管疾病的发生。由于油酸对低密度脂蛋白胆固醇的作用呈中性，在降低高密度脂蛋白胆固醇的程度上比亚油酸低，没有多不饱和脂肪酸过量摄入后所带来的因氧化而引起的负面影响。因此，在某种程度上，单不饱和脂肪酸要优于多不饱和脂肪酸。“地中海”式饮食中橄榄油富含油酸，当地居民血中胆固醇水平和心脏病发生率都相对较低[17]。

图2 3种鱼油中饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱 和脂肪酸的比例

Figure 2 The percentage of saturated fatty acids, monounsaturated fatty acids and polyunsaturated fatty acids in three marine fish oils

3种鱼油中都含有丰富的油酸，尤其是三文鱼中的含量高达27.94%，所以具有极高的营养价值。棕榈油酸(C16:1)具有增加细胞膜流动性，抑制肿瘤，减轻炎症及糖尿病和心脏病的特殊功效。棕榈油酸尽管在乳脂中的含量极微，却能够加强血管的代谢过程，可降低患高血压和中风的风险。同时，单不饱和脂肪酸与DHA、EPA具有协同作用，可用于治疗白细胞营养不良。3种鱼油中均含有较高比例的棕榈油酸，尤其是金枪鱼中高达10.03%，说明其具有较高的药用价值。

另外，3种海洋鱼油中C20:1和C22:1的含量明显高于动植物油脂。试验发现：C20:1和C22:1的总含量影响EPA和DHA的总含量。随着C20:1含量的依次减少，C20:5的含量依次增加；同时，随着C22:1含量依次增加，C22:6的含量依次减少。两组脂肪酸呈现出此消彼长的关系，说明在脂肪酸代谢途径中，C20:1和C22:1作为前体物通过酶系催化生成C20:5和 C22:6，因而不断被转化。这与邓泽元等[18]关于鄱阳湖淡水鱼脂肪酸的变化规律相似，可能与鱼体内脂肪酸的合成代谢规律存在密切相关性。因为饱和脂肪酸在去饱和酶脂肪酶的作用下首先转化为单不饱和脂肪酸，而C20:1和C22:1作为重要的中间产物控制着C20:5和C22:6的转化率，然而其具体的代谢途径及产物转化机制有待于进一步研究。

2.2 鱼油甘三酯脂肪酸在sn-1,3和sn-2位的分布

饱和脂肪酸，单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸在sn-1,3 和sn-2位的分布比例情况见图3。对于饱和脂肪酸，除了金枪鱼sn-2位高于sn-1,3位约10%以外，凤尾鱼和三文鱼中饱和脂肪酸在sn-2和sn-1,3位的分布比例相当；3种鱼油中单不饱和脂肪酸在sn-1,3位的比例显著高于其在sn-2 位的，其中三文鱼中sn-1,3的单不饱和脂肪酸高达54.9%；对于多不饱和脂肪酸来说，情况恰好相反，3种鱼油中多不饱和脂肪酸倾向于分布在sn-2位，不仅有利于其在体内代谢和利用，而且在加工和贮藏过程中还不易被氧化。

1. SFA 2. MUFA 3. PUFA图3 3种鱼油中饱和、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸 sn-1,3和sn-2位的分布

Figure 3 The positionaldistribution of SFA, MUFA and PUFA from three marine fish oils

由表2可知，3种海洋鱼油sn-2位脂肪酸组成中，饱和脂肪酸(SFA)占20%以上，含量最为丰富的是C16:0，占10%以上，凤尾鱼最多(27.35%)；单不饱和脂肪酸(MUFA)占20%左右，C18:1的含量最多，占10%左右，三文鱼最高(16.15%)；多不饱和脂肪酸(PUFA)含量高达30%以上，金枪鱼最多(40.86%)。其中，sn-2位上PUFA主要由EPA和DHA构成，EPA含量最多的是三文鱼(17.54%)，金枪鱼中DHA含量最多(25.88%)。不饱和脂肪酸(UFA)在sn-2位的含量占到总脂肪酸含量的一半以上，这种不饱和脂肪酸分布的特征有利于机体对其吸收和利用。

同样，sn-2位上的C20:1和C22:1的含量也影响EPA和DHA在sn-2位上的含量。从表2还可以看出，金枪鱼、凤尾鱼、三文鱼中sn-2位上C20:1含量依次减少，而sn-2位上C20:5的含量依次增加；而金枪鱼、凤尾鱼、三文鱼中sn-2位上C22:1含量依次增加，而sn-2位上C22:6的含量依次减少，这与C20:1和C22:1总脂肪酸含量影响C20:5和C22:6总脂肪酸含量的变化规律一致。说明在脂肪酸代谢途径中，C20:1和C22:12种单不饱和脂肪酸作为前体物通过一系列酶催化生成C20:5和C22:6，然而具体代谢通路和各种酶所起的作用有待学者们进一步详细研究来证实。

2.3 鱼油甘三酯中n-3和n-6系列脂肪酸的组成和位置分布

多不饱和脂肪酸按照双键位置的不同可分为n-3和n-6系列。由图4可知，在多不饱和脂肪酸中，n-3含量和比例明显高于n-6多不饱和脂肪酸，其中，n-3系列占20%以上，而n-6系列仅占5%以下。膳食中补充n-3和n-6系列脂肪酸的摄入量有助于人体健康，然而，n-3和n-6系列多不饱和脂肪酸的比例平衡远比其含量重要。膳食中n-3多不饱和脂肪酸摄入不足会增加罹患癌症和心脑血管疾病的风险。FAO/WHO(1994)推荐摄入n-3/n-6多不饱和脂肪酸的比例>4[19]。本试验表明：3种鱼油中二者的比例均>10，因此，这3种鱼成为非常理想的平衡n-3和n-6系列脂肪酸的食物。在西方膳食和中国内陆居民饮食结构中，n-3多不饱和脂肪酸的摄入量严重不足，所以多食用海鱼有助于平衡n-3 和n-6 PUFA的摄取，降低心脑血管疾病和癌症的发病率。

表2 3种鱼油中sn-2位脂肪酸的组成†Table 2 sn-2 Fatty Acid Compositions of Anchovy, Tuna and Salmon Oils %

† 采用摩尔百分比表示脂肪酸含量；同行不同字母表示差异显著，P<0.05。

图4 3种鱼油中n-3和n-6系列脂肪酸的比例

Figure 4 The percentage ofn-3 andn-6 series fatty acids from three marine fish oils

由图5可知，n-3多不饱和脂肪酸在sn-2位的比例显著高于其在sn-1,3位的；而对于n-6多不饱和脂肪酸而言，仅有金枪鱼中在sn-1,3位的比例明显高于sn-2位的，凤尾鱼和三文鱼中没有明显的位置分布差别。同时，金枪鱼中n-6多不饱和脂肪酸在sn-1,3位的含量显著高于其他2种海鱼的，从而导致金枪鱼中n-6多不饱和脂肪酸的含量相对较高，而3种鱼油n-6多不饱和脂肪酸在sn-2位上的含量均维持在2%左右，并无明显差异性，可能与海鱼的品种及其生活的海域环境有关[20]。

图5 3种鱼油中n-3和n-6系列脂肪酸在sn-2和 sn-1,3位的分布

Figure 5 The positional distribution ofn-3 andn-6 series fatty acids from three marine fish oils

3 结论

鱼油甘三酯中脂肪酸的组成及其位置分布是评价其营养价值和功能性质的重要指标。海洋鱼油富含多不饱和脂肪酸，n-3与n-6 PUFAs之间的比例均>10，符合FAO/WHO推荐摄入的标准(>4)；Lipozyme RM IM可以有效水解PUFAs，SFAs和MUFAs主要分布于sn-1,3位上，而PUFAs主要位于sn-2位上，这种分布特征有利于机体对脂肪酸的利用，同时具有耐氧化性，因此海洋鱼油可以作为n-3和n-6 PUFAs的优质原料来添加于膳食中。该研究为分析甘三酯中脂肪酸的位置分布提供了一条新途径，也为评价海洋鱼油的消化和吸收特性及其氧化稳定性提供了理论依据。

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Compositionandpositionaldistributionoffattyacidsintriacylglycerolsofthreemarinefishoils

In this study, the purified triacylglycerols (TAG) of selected marine fish oils (anchovy, tuna and salmon oils) were subjected to stereospecific hydrolysis by an sn-1, 3-specific lipase (Lipozyme RM IM) which cleaves selectively the sn-1 and sn-3 position ester bonds of TAG yielding tosn-2-monoglycerides (2-MAG). After lipase hydrolysis, the released free fatty acids andsn-2-MAG were isolated by thin-layer chromatography (TLC). The original TAG andsn-2-MAG were respectively converted to fatty acid methyl esters (FAME), then analyzed by gas chromatography(GC). Results showed that TAG of these marine fish oils were made up of unsaturated fatty acids mainly accounting for 60%. Polyunsaturated fatty acids are preferentially located atsn-2 position, whose percentage is more than 50%, while saturated fatty acids and monounsaturated fatty acids are most distributed insn-1,3 position. The ratio betweenn-3 andn-6 PUFAs is greater than 10, which is in line with the FAO/WHO recommended intake standard (> 4) and is ideal forn-3 PUFA natural nutritional supplements.

TAG; lipozyme RM IM;sn-2 monoglyceride; thin-layer chromatography; gas chromatography

张惠君，男，讲师，江南大学在读博士研究生。

王兴国(1962—)，男，江南大学教授，博导，博士。

E-mail：wxg1002@qq.com

2017—03—06

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.09.012