苦参素对HeLa细胞自噬性死亡的影响

谢 春(商丘医学高等专科学校，河南 商丘 476000)

苦参素对HeLa细胞自噬性死亡的影响

谢 春
(商丘医学高等专科学校，河南 商丘 476000)

目的探讨苦参素对人宫颈癌HeLa细胞自噬的影响，初步探讨其作用机制。方法不同浓度(1.0、1.5、2.0 g·L-1)的苦参素作用于HSV-2感染的人宫颈癌HeLa细胞，RFP-GFP-LC3和HPV16 DNA共转染后12 h和36 h收集细胞，透射电子显微镜观察细胞自噬活性的改变，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及Western Blot检测在HeLa细胞中HSV-2感染引起自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的变化。结果病毒感染组自噬小体明显增多，多于对照组(P<0.05)；病毒感染组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ明显升高，高于对照组(P<0.05)；与对照组比较，作用72 h 后, 1.0、1.5、2.0 g·L-1苦参素组均能不同程度提高HeLa细胞的自噬活性，均可见到自噬小体的增加，其自噬相关蛋白LC3-Ⅱ蛋白表达量明显增加(P<0.05)，HSV-2释放滴度明显降低(P<0.05)。结论苦参素能通过增强HeLa细胞自噬活性，减少HSV-2感染后的释放与产生。

HeLa细胞；宫颈癌；苦参素；细胞自噬；单纯疱疹病毒2型

单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus 2 type, HSV-2)主要通过性接触传播,引起生殖器官的炎症和疱疹。最近发现HSV-1和人类巨细胞病毒(human giant cell virus，HCMV)可诱导自噬，进一步证明病毒DNA能够促进自噬。有研究用透射电镜发现HSV感染的交感神经和鼠成纤维细胞样品存在大量包裹有病毒粒子的自噬泡；随后将病毒内部的自噬抑制蛋白缺失发现病毒滴度显著下降；如果将自噬形成的控制基因沉默后，病毒滴度会显著上升，这表明自噬可能是通过自噬泡降解病毒从而有抗感染作用。

苦参素是以苦参碱为代表的骨架结构,对苦参素提纯测定和药效作用的深入研究发现,苦参素具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎作用,还具有升高白细胞和Th细胞, 调节免疫等作用[1]。但关于苦参素对人宫颈癌HeLa细胞自噬活性的影响国内外文献报道较少。本研究通过探讨不同浓度苦参素对HeLa细胞自噬活性的影响, 为苦参素治疗宫颈癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1主要材料与细胞

1.1.1 主要材料 HeLa细胞株和HSV-2病毒株由郑州大学医学院肿瘤病理研究室提供；苦参素(氧化苦参碱含量≥98%)购自陕西昂盛生物医药科技有限公司；小牛血清购自杭州四季青生物材料工程有限公司；所有实验用试剂盒均购自美国Sigma公司。

1.1.2 细胞分组及处理方法 本研究将细胞分为HSV-2病毒感染组和空白对照组，并进一步按照苦参素的不同浓度对病毒感染组进行分组。

1.2方法

1.2.1 细胞培养及传代 HeLa细胞于含体积分数10%的胎牛血清和100 u·mL-1青霉素及100 mg·mL-1链霉素的DMEM完全培养基中，在37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养。

1.2.2 HSV-2的CCID50滴定及感染 接种浓度为1×105·mL-1的HeLa细胞培养，5 d后观察并记录全部孔的细胞病变再根据卡波氏公式计算出病毒滴度；在攻毒实验前测定病毒的CCID50，换算成空斑形成单位，在细胞传代24 h后进行染毒实验，将病毒加入培养基中，十字交叉摇动培养板混匀。

1.2.3 透射电子显微镜观察细胞自噬 用普通培养、RFP-GFP-LC3和HPV16 DNA共转染后12 h和36 h后收集细胞，离心，细胞沉淀，用含有质量分数3%戊二醛的0.1 mol·L-1PBS固定2 h。用PBS清洗之后，用质量分数1%四氧化锇固定2 h，再用浓度梯度(50%～90%)的乙醇脱水，然后用丙酮进一步脱水，用环氧树脂包埋，浸透过夜，聚合，超薄切片机切片，然后用乙酸双氧铀和柠檬酸铅对超薄切片进行负染色。在透射电子显微镜下观察。

1.2.4 苦参素调控自噬活性 取对数生长期的HeLa细胞, 按1×105·mL-1的浓度接种于96 孔培养板, 每孔总反应体系为200 μL。实验组分别加入不同浓度的苦参素, 使其终浓度达到工作浓度,分别为0.0、1.0、1.5、2.0 g·L-1。每个浓度组设3个复孔, 用RPMI-1640培养基200 μL设为调零点, 加入不含苦参素的细胞培养基(细胞液、培养基各为100 μL)为空白对照组,将各组细胞继续培养24、48、72 h；然后进行相关蛋白的测定。

1.2.5 Western Blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以及Western Blot检测在HeIa细胞中HSV-2感染引起自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的变化。

2 结果

2.1细胞自噬情况变化病毒感染组自噬小体明显增多，多于对照组(P<0.05)。

2.2自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的变化HeIa细胞中HSV-2病毒感染引起自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的变化，发现病毒感染组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ明显升高，高于对照组(P<0.05)，提示HeLa细胞中出现自噬活性增强现象。

2.3苦参素对Hela细胞自噬活性的影响与空白对照组比较，作用72 h 后, 1.0、1.5、2.0 g·L-1苦参素组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ蛋白表达量明显增加(P<0.05)，而各浓度苦参素组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.4苦参素对Hela细胞病毒释放表达的影响与对照组比较，作用72 h 后, 1.0、1.5、2.0 g·L-1苦参素组HSV-2释放滴度明显降低(P<0.05)，而各浓度苦参素组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 苦参素对HeLa细胞自噬活性和HSV-2滴度的影响

3 讨论

疱疹病毒是已知感染人类病毒种类最多的一类病毒，为双链DNA病毒。HSV-2主要通过性接触传播引起生殖器官的炎症和疱疹。HSV-2感染机体后能否致病取决于HSV-2的毒力，即HSV-2在靶细胞的内增殖及播散的能力。美国孕妇HSV-2感染率为35.17%，在发展中国家，HSV-2的感染率更高。该病毒与宫颈癌的发生有密切的关系。但目前尚无特效药物控制HSV-2感染的发生和复发[2]。HSV-2具有很大的危害性，其感染已成为医学上一个十分棘手的问题。

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一, 严重威胁女性的生命健康。自噬是真核细胞普遍存在的生命现象,在自噬过程中,首先是在细胞质内形成双层膜结构包裹的成分(受损的、变性或衰老的蛋白质以及细胞器)称为自噬体。肿瘤细胞在放、化疗过程中可活化自噬信号,作为一种存活机制介导获得性耐药而保护细胞免遭死亡[3]。最近发现HSV-1和HCMV可诱导自噬，进一步证明病毒DNA能够促进自噬。因此,通过抑制自噬信号增强肿瘤细胞对放、化疗治疗的敏感性成为当前国内外抗肿瘤治疗研究的热点之一[4]。我们的研究发现，病毒感染组自噬小体明显增多，说明HeLa细胞被HSV-2感染后激活其自噬活性，进行相应的修复。

病毒内部的自噬抑制蛋白缺失可导致病毒滴度显著下降；如果将自噬形成的控制基因沉默后，病毒滴度会显著上升，这表明自噬可能是通过自噬泡降解病毒，从而有抗感染作用。自噬过程受一系列自噬相关基因的严格调控[5-6]。LC3-Ⅰ在正常情况下是弥散分布在细胞浆中的，转变为LC3-Ⅱ则特异结合在自噬泡的内外膜上，因此LC3-Ⅱ成为检测自噬的标志物[3-4]。本研究还发现病毒感染组的自噬相关蛋白LC3-Ⅱ明显增多。

苦参碱类药物具有抑制肿瘤增殖、诱导分化和凋亡、抗肿瘤浸润和远处转移、抑制肿瘤新生血管形成、减轻肿瘤炎症和抑制肿瘤耐药性、减低化疗不良反应、增强肿瘤宿主免疫等功能[7-8]。本研究结果显示,苦参素可以调节HeLa细胞自噬活性，不同浓度的苦参素对HeLa细胞的自噬活性改变并无明显差异。进一步分析其病毒释放及产生发现，与对照组比较应用苦参素的病毒感染组其病毒滴度明显降低。

综上所述,苦参素可能通过调控HeLa细胞的自噬活性，抑制被感染HSV-2的HeLa细胞释放与产生病毒，降低病毒滴度。苦参素有望成为治疗宫颈癌的一种药物,但具体机制仍需进一步深入研究。

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ImpactofSophoraontheAutophagyofHeLaCells

XIE Chun
(ShangqiuMedicalCollege，Shangqiu476000，China)

ObjectiveTo explore the impact of sophora on human cervical cancer HeLa cell autophagy and to explore its action mechanism.MethodsDifferent concentrations (1.0, 1.5, 2.0 g·L-1) of sophora was used for human cervical cancer HeLa cells after HSV-2 infection, The cells were collected in a total of 12 hours and 36 hours after RFP-GFP-LC3 and HPV16 DNA transfection, the autophagy activity change was observed by using transmission electron microscopy, SDS polyacrylamide gel electrophoresis and Western Blot detection were used to detect the autophagy related protein LC3-Ⅱ changes in the HeLa cells after HSV-2 infection.ResultsThe autophagosome was obviously increased in the virus infection group, compared with the control group (P<0.05); the autophagy related proteins LC3-Ⅱ content was increased significantly in the virus infection group, compared with the control group (P<0.05).After 48 hours and 72 hours, compared with the control group, 1.0, 1.5, 2.0 g·L-1of sophora could improve the autophagy activity of HeLa cells (P<0.05); the autophagosome was significant increased (P<0.05); the autophagy related protein LC3-Ⅱ was significantly increased (P<0.05), the HSV-2 release drop degree was decreased obviously (P<0.05).ConclusionSophora can improve the autophagy activity of HeLa cells, reduce the release of HSV-2 after virus infection.

HeLa cells; cervical cancer; sophora; cellautophagy; herpes simplex virus 2 type

商丘市科技攻关项目(编号：153060)

谢春(1974-)，女，副教授，主要从事微生物与免疫研究。E-mail：674434085@qq.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.05.001

R737.33;R730.23

A

1673-5412(2017)05-0369-03

2017-01-23)