一种长链叔胺pH敏感抗菌牙体修复材料的合成与抗菌性能

商 惠, 徐心源, 梁静鸥, 程 磊, 李建树*(1. 四川大学 a. 高分子科学与工程学院 高分子材料工程国家重点实验室,b. 华西口腔医院 口腔疾病国家重点实验室，四川 成都 610065)

·研究论文·

一种长链叔胺pH敏感抗菌牙体修复材料的合成与抗菌性能

商 惠1a, 徐心源1a, 梁静鸥1b, 程 磊1b, 李建树1a*
(1. 四川大学 a. 高分子科学与工程学院 高分子材料工程国家重点实验室,b. 华西口腔医院 口腔疾病国家重点实验室，四川 成都 610065)

口腔粘结剂常被用于粘结复合树脂和牙本质或牙釉质，但由于残留细菌会导致继发龋病从而使得粘结剂修复体不能提供长期疗效，目前市场上使用的粘结剂均无法避免细菌滋生。本文采用两步法合成了一种甲基丙烯酸酯基封端的长链叔胺，通过柱层析进行纯化，其结构经1H NMR和FT-IR表征，并对其抗菌性能进行了研究。结果表明：该材料可通过质子化作用提升口腔pH值抑制细菌滋生。

长链叔胺; 合成; pH敏感; 抗菌性能; 牙体修复

近年来，“最小损伤”的口腔修复理念深入人心，在口腔修复领域占据着主导地位。促进完善“最小损伤”理论的一个重要技术进步就是粘结剂修复技术[1]。自1955年，Buonocore[2]将釉质酸蚀技术应用于口腔粘结剂后，修复就开始步入历史舞台。至今，口腔粘结剂已经历了七代变革，从实际操作到产品性能均有了质的飞跃。但由于继发龋的生成、修复体的断裂以及边缘微渗漏等使得口腔粘结剂修复无法长时间保持有效。修复材料引起细菌滋生和黏附是引发继发龋的主要原因[3-4]。

因此，针对改善口腔粘结剂抗菌性的研究越来越多，其基本原则是不损伤粘结性能，添加某种具有抗菌性单体，例如季铵盐、纳米颗粒和其他具有抗菌作用单体等等。有研究者在粘结剂体系中引入了纳米颗粒，在不影响原材料物理机械性能的前提下，利用纳米颗粒的缓慢释放达到长期有效抗菌的目的[5-8]。同时，也有研究者尝试将一种新的季铵盐单体加入粘结剂中，利用季铵盐单体的碳碳双键以光固化的方式与商业化粘结剂交联在一起，能有效避免抗菌单体从粘结剂中渗出且这种单体有较好的抑菌能力[9]。季铵盐的抗菌性优异，但其细胞毒性和生物相容性不好。Palermo等[10]的研究中提到伯胺和叔胺的抗菌性及溶血性能与其质子化程度有关，即具有pH敏感性，而口腔粘结剂的应用环境存在着酸碱变化，使得叔胺的pH敏感性可以得到充分应用。

本文采用两步法合成了一种甲基丙烯酸酯基封端的长链叔胺(MADMAE)，通过柱层析进行纯化，其结构经1H NMR和FT-IR表征。并研究了其抗菌性能进行了研究。该材料可通过质子化作用提升口腔pH值继而抑制细菌滋生，同时利用其叔胺基团质子化产生的正电荷吸附表面带负电荷的细菌，并利用其长链破坏细胞膜的完整性达到杀菌效果。调节口腔微环境抑制细菌的滋生同时在细菌滋生的同时由具备杀菌作用为改性粘结剂提供了新的思路和途径，另外叔胺类较低的细胞毒性也是一个不可忽略的优势。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UNITY INOVA-400型核磁共振仪(氘代氯仿为溶剂，TMS为内标)；Nicolet 6700型傅里叶红外光谱仪(涂膜)；PHS-3C型pH计。

甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA， 98%)， 1-溴十二烷(98%)，N-甲氨-2-羟基乙胺(98%)，甲基丙烯酰氯(分析纯)，对苯二酚(分析纯)，上海阿拉丁；三乙胺(分析纯)，四氢呋喃(分析纯)，二氯甲烷(分析纯)，无水碳酸钠(99%)，乙醇(分析纯)，偶氮二异丁腈(98%)，碱性氧化铝(98%)，石油醚(分析纯)，四川海宏；4Å分子筛，科龙试剂公司；实验用水为去离子水。

1.2 合成

(1) DMAE的合成

在反应瓶中依次加入1-溴十二烷11.98 mL(49.9 mmol)、N-甲基-2羟基乙胺6.02 mL(76.5 mmol)、无水碳酸钠6.00 g(56.6 mmol)和乙醇30 mL，搅拌下回流(60 ℃)反应8 h。抽滤除去溴化钠和碳酸，滤液于50 ℃旋蒸使溶液中的溴化钠和碳酸钠析出，并除去乙醇和过量N-甲基-2-羟基乙胺，抽滤，滤液于25 ℃真空干燥过夜除去乙醇，经硅胶柱层析[洗脱剂：V(甲醇) ∶V(二氯甲烷)=1 ∶7,加入体积比4‰氨水]纯化得DMAE。

(2) MADMAE的合成

将反应瓶用热风枪烘烤以除去氧气和水分，加入DMAE 0.805 g、三乙胺0.549 g、对苯二酚4.4 mg(摩尔比为1 ∶1.5 ∶0.01)和二氯甲烷10 mL，冰浴冷却下滴加甲基丙烯酰氯0.386 mL，滴毕，于0 ℃避光回流反应8 h。旋蒸除去二氯甲烷，用四氢呋喃萃取，抽滤除去三乙胺盐，滤液于30 ℃旋蒸除去四氢呋喃(析出三乙胺盐)，抽滤除去三乙胺盐，滤液通15 min氩气，置于-20 ℃冰箱保存，经硅胶出层析[洗脱剂：V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=7 ∶1，加入体积比4‰氨水]纯化得MADMAE。

1.3 pKa测试

DMAEMA、 DMAE和MADMAE在不同条件下的质子化程度及pKa值通过酸碱滴定实验测得。测试方法：取 DMAEMA 30 mg溶解在5 mL去离子水中，并用0.1 mol·L-1盐酸标准液调节pH至1.5，用0.1 mol·L-1NaOH标准液通过微量进样泵按一定间断时间滴加到溶液中并快速搅拌。通过pH计实时监测随着NaOH滴加产生的pH值变化并作图得到pH滴定曲线。pKa值为pH滴定曲线上的两个拐点的平均值。DMAE和MADMAE的pKa测试方法与上述方法一致，同时计算不同pH条件下物质质子化程度(α)。

1.4 抗菌性能测试

最小抑菌浓度(MIC)根据国家临床实验室标准委员会(NCCLS)制定的标准微稀释法测定。将测试单体溶解于脑心浸液(BHI)液体培养基中，使用0.2 μm过滤器滤过抗菌液备用，挑选变异链球菌菌落3～5个，接种于4～5 mL BHI液体培养基中，于37 ℃兼性厌氧环境孵育12 h，增菌后的对数生长期菌液使用BHI液体培养基稀释至0.33麦氏浓度，约为 108CFU·mL-1。将菌悬液进行1 ∶100稀释后备用，取96孔板，加入2倍梯度稀释的抗菌液，每组设置3个平行组100 μL，于每孔内加入100 μL菌液，于37 ℃兼性厌氧环境孵育24小时，以肉眼观察药物最低浓度无细菌生长者，即为该物质的MIC。

2 结果与讨论

2.1 表征

(1)1H NMR

1H NMR谱图能为研究分子的化学结构提供很多的信息，将原始的信号经过一系列的处理和傅里叶变换得到最直观的信息就是化学位移。图1为DMAE的1H NMR谱图，从图中可以看出，DMAE骨架上面的亚甲基、甲基a、 b、 c、 d、 e、 f、 g在核磁图上分别出现特征峰，且通过积分得出a、 b、 c、 d、 e、 f、 g峰面积分别为0.58、 0.63、 0.68、 0.94、 0.62、 0.58、 0.96，峰面积比约为2 ∶2 ∶2∶3 ∶2 ∶2 ∶3，与实际DMAE碳链上碳原子所带的氢原子比例相符合。通过核磁数据表明1-溴十二烷与N-甲氨-2羟基乙胺反应成功合成了DMAE。

图2为MADMAEN的1H NMR谱图。从图中可以看出，DMAE与甲基丙烯酰氯反应后出现了双键特征峰，并且通过积分得出了各个峰面积，与a、 b、 g三个碳原子所带的氢原子比例相符合。表明形成了产物MADMAE合成成功。

δ图1 DMAE的1H NMR谱图Figure 1 1H NMR spectrum of DMAE

δ图2 MADMAE的1H NMR谱图Figure 2 1H NMR spectrum of MADMAE

(2) FT-IR

图3为DMAE和MADMAE的FT-IR谱图。由图3可以看出，DMAE的特征峰是3 356.63 cm-1处的O—H伸缩振动峰和1 040.07 cm-1处的C—N伸缩振动峰；MADMAE的特征峰分别为1 722.61 cm-1处的C=O伸缩振动峰，1 162.95 cm-1处C—O伸缩振动峰以及1 638.78 cm-1处的C=C伸缩振动峰，同时伴随着3 356.63 cm-1处的O—H伸缩振动峰消失。

ν/cm-1图3 DMAE和MADMAE的FT-IR谱图Figure 3 FT-IR spectra of DMAE and MADMAE

2.2 pKa测试结果

pKa是评价pH敏感材料潜在应用一个最为重要的参数。在本文研究中，为了测定不同分子准确的pKa值，我们通过标准酸碱滴定实验来测定。如图4a所示，随着NaOH的滴加，DMAEMA的滴定图中在pH=7.69和pH=8.91处有两个转折点，基于这两点的可知DMAEMA的pKa值为8.29。根据对应的质子化程度图图4b可以看出在pH小于6时DMAEMA基本能完全质子化，进而说明在口腔的酸性pH环境下DMAEMA能完全质子化，随着质子化程度的增加产生抗菌性。

V(NaOH)/μL

α图4 电位计的酸碱滴定实验，DMAEMA的滴定曲线(a)和质子化程度曲线(b)Figure 4 Titration curve(a) and protonation degree curve(b) of DMAEMA

图5为DMAE的滴定曲线(a)和质子化程度曲线(b)。由图5a所示，DMAE滴定曲线在pH=6.03和pH=7.22处有两个转折点，DMAE的pKa值为6.63。图5b表明在外界环境pH低于5时，DMAE能完全质子化，这非常符合口腔龋病环境的应用条件。

图6为MADMAE的滴定曲线(a)和质子化程度曲线(b)。由图6a可见，在pH=4.15和pH=4.55处存在两个转折点，基于这两点得到MADMAE的pKa值为4.43。图6b表明MADMAE质子化程度要达到50%需要环境pH低于4.5，而完全质子化则需要pH低于3，如此极大地限制了MADMAE在口腔环境中的应用，也在一定程度上解释了MADMAE缺乏抗菌性的原因。

V(NaOH)/μL

图5 电位计的酸碱滴定实验，DMAE的滴定曲线(a)和质子化程度曲线(b)Figure 5 Titration curve(a) and protonation degree curve(b) of DMAE

2.3 抗菌性能

化合物的MIC测试结果见表1所示。由表1可以看出，DMAE的抑菌浓度显著低于DMAEMA，而MADMAE几乎无抗菌性。原因可能是DMAE疏水长链的引入提高了叔胺质子化程度，从而提高了其抗菌性，而根据MADMAE的质子化数据可以看出变异链球菌在pH 4.5的酸性情况下质子化程度在50%左右，因而未体现出抗菌性。三种物质都是利用叔胺质子化达到抗菌的目的，而不同的结构使得其质子化程度不同从而影响抗菌效果，DMAEMA能在口腔龋病环境下完全质子化并未体现出其抗菌效果而DMAE在酸性条件下体现出良好的质子化效果和抗菌能力使其非常适合成为牙科粘结材料抗菌分子。

V(NaOH)/μL

图6 电位计的酸碱滴定实验：MADMAE的滴定曲线(a)和质子化程度曲线(b)Figure 6 Titration curve(a) and protonation degree curve(b) of MADMAE

表1 化合物的MIC数据Table 1 MIC data of the compounds

合成了一类新的叔胺分子用于牙科粘结材料，利用其叔胺基团质子化产生的正电荷与细菌细胞膜负电的静电作用，达到与季铵盐相似的作用机理进行杀菌。合成的DMAE既具有pH敏感性又具有良好的抗菌性，其可以在口腔龋病酸性环境下完全质子化，同时体现出良好的抗菌性。DMAEMA的pKa测定和抗菌测试结果表明其质子化程度很高但抗菌性却很微弱。但在DMAE上引入双键后的MADMAE因pKa值过低，而无法在变异链球菌的生长环境下产生较高程度的质子化，从而在抗菌实验中无法体现抗菌性。基于以上结果，DMAE在三种分子中的质子化效果和抗菌性最佳，长链叔胺结构物质具有很好的pH敏感性可用于微环境的调控，但其抑菌浓度仍无法与现今常用的季铵盐抗菌效果相较，还需进一步研究。

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SynthesisandAntibacterialActivityofALongChainTertiaryAmineStructurepH-ResponsiveandAntibacterialMaterialforToothRestoration

SHANG Hui1a, XU Xin-yuan1a, LIANG Jing-ou1b, CHENG Lei1b, LI Jian-shu1a*
(a. State Key Laboratory of Polymer Materials Engineering, College of Polymer Science and Engineering; b. State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, 1. Sichuan University, Chengdu 610065, China)

Dental adhesives are often used for bonding composite resin and dentin or enamel. Nowadays, dental adhesives have achieved strong adhesion stress and easier operation. Nevertheless, the restorative adhesives can not provide long-term efficacy because residual bacteria can cause secondary caries. All current dental adhesives can not resist bacterial growth. In this paper, a long chain tertiary amine structure pH-responsive and antibacterial material based on methylacrylic acid ester was synthesized by two steps reaction and the pure product was obtainedviacolumn chromatography. The structure was characterized by1H NMR and IR. The antibacterial activity was investigated. The results showed that it can maintain oral acid-base balance and avoid bacterial growth through its antibacterial effect.

tertiary amine; synthesis; pH-responsive; antibacterial activity; tooth restoration

2017-03-21;

2017-09-29

国家重点研发计划(2016YFC1100404)； 国家自然科学基金资助项目(51573110)

商惠(1990-)，女，汉族，山东菏泽人，硕士研究生，主要从事生物医用高分子材料的研究。 E-mail: huishanggz@163.com

李建树，教授， Tel. 028-85466755， E-mail: jianshu_li@scu.edu.cn

TB324

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.11.17063