雄性激素受体抑制剂比卡鲁胺对SCID鼠骨质疏松影响的实验研究

2017-11-20 08:50杨政兴陈忠铭刘美宝陈夏韧
中国医学创新 2017年28期
关键词:骨质疏松实验研究

杨政兴+陈忠铭+刘美宝+陈夏韧

【摘要】 目的:研究雄性激素受体抑制剂(比卡鲁胺)对前列腺癌大鼠的睾酮、雌性激素的影响以及对骨质疏松的标识物的影响。方法:选取40只SCID鼠作为研究对象,正常组10只,前列腺癌模型组30只,其中前列腺癌模型组分为实验组15只,对照组15只。实验组分别给予比卡鲁胺0.2 mg/mL QD,灌胃,对照组用等量生理盐水代替。分别于给药后1、2、4周,采集实验组及相应对照组裸鼠的血液及瘤体。对睾酮、雌性激素、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶分别用ELISA的双抗体夹心法进行检测并记录分析。结果:给药2、4周后,实验组中睾酮明显低于对照组与正常组(P<0.05),其他相关水平变化不明显(P>0.05)。给药4周后对照组和实验组雄性激素受体免疫组化平均灰度值(IOD)比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:比卡鲁胺对在短期对前列腺癌大鼠中的睾酮影响明显,对雌性激素无明显影响,对骨质疏松的指标影响小。

【关键词】 雄性激素受体抑制剂; 骨质疏松; 实验研究

【Abstract】 Objective:To investigate the effects of the androgen receptor inhibitor bicalutamide on testosterone and estrogen,as well as the osteoporosis markers in rats with prostate cancer.Method:Forty SCID rats were assigned to the normal group including 10 rats or the prostate cancer model group including 30 rats.The rats in the prostate cancer model group were further divided into the test group including 15 rats,and the control group including 15 rats.The test group was given bicalutamide 0.2 mg/mL QD,and rats in the control group were given normal saline following the same dosing schedule.Blood and tumor were separately collected from rats in the test group and control group at 1 week,2 weeks and 4 weeks post-treatment.Testosterone,estrogen,ALP,and ACP were separately detected by double antibody sandwich ELISA, and then recorded and analyzed.Result:Testosterone in the test group was significantly lower than in the control and normal groups(P<0.05);there were no significant changes in any other relevant indicators(P>0.05).After 4 weeks,compared the mean gray value of androgen receptor immunohistochemistry in the control group and the experimental group,the difference was statistically significant(P<0.05).Conclusion:In the short term,bicalutamide has significant impact on testosterone,no significant impact on estrogen,and minor impact on the osteoporosis indicators in rats with prostate cancer.

【Key words】 Androgen receptor inhibitor; Osteoporosis; Experimental study

First-authors address:Fuzhou Second Hospital Affiliated to Xiamen University,Fuzhou 350000,China

doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2017.28.008

本次动物实验研究前列腺癌的大鼠服用比卡鲁胺后对性激素水平的影响,以及对骨质疏松症患者骨代谢主要骨代谢指标的影响,即抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRAP-5b)和骨质疏松的指标骨源性碱性磷酸酶(BALP),研究比卡鲁胺对前列腺癌大鼠是否对骨质疏松影响[1-3],为研究临床药物对骨质疏松的影响、分类诊断、预防及治疗提供实验基础,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 實验动物 选取40只SCID鼠作为研究对象,其中正常组10只,前列腺癌模型组30只,其中前列腺癌模型组分为实验组15只,对照组15只。雄性BALB/C裸鼠35只,鼠龄为4~6周,体重为18~20 g,由中科院上海实验动物中心提供。裸鼠饲养条件:SPF级,在层流架内自由喂养,自由摄入饲料,饮水无限制,并且均经过严格消毒灭菌处理。

1.2 前列腺癌细胞株 LNCaP细胞株由中科院上海细胞生物学研究所提供,LNCaP细胞培养于含10%的胎牛血清的1640培养基中,培养箱温度保持37 ℃、5.0% CO2培养环境,1~2 d换液1次,当细胞处于对数生长期时用0.25%胰酶消化后收集,用生理盐水洗3次,制成单细胞悬液备用。endprint

1.3 模型建立 裸鼠造模:将LNCaP细胞培养后,取处于对数生长期的细胞进行实验。首先将其采用胰酶进行消化处理,浓度为0.25%,然后向其中加入完全培养液,待消化反应终止后行离心分离处理,转速和离心时间分别为1000 r/min和5 min。处理后将所得样品重悬于完全培养基,用台盼蓝拒染法检验细胞存活率大于90%的细胞悬液可用。用1 mL无菌注射器抽取0.2 mL混悬液,其中有5×107个细胞,将其在实验大鼠的右前肢腋部进行皮下注射。待1周后,可在其右前肢腋窝处可肉眼看到有黄豆大小瘤块形成。

1.4 实验给药与处理 实验组分别给予比卡鲁胺0.2 mg/mL QD,灌胃,比卡鲁胺(非甾体类抗雄激素药物,与黄体生成素释放激素(LHRH)类似物或外科睾丸切除术联合应用于晚期前列腺癌的治疗)按照人的剂量换算成裸鼠的剂量制成悬液,分别于给药后1、2、4周,采集实验组及相应对照组裸鼠的血液及瘤体。裸鼠采血前先用水合氯醛(200 μL/只)麻醉后,75%酒精消毒裸鼠腹部皮肤,打开腹腔,找到腹主动脉取血。血液由1000 r/5 min离心分离出血清,-20 ℃分存。瘤体取材后放入4%多聚甲醛固定液中固定24 h,固定后制成石蜡切片。

1.5 血清指标检测 人前列腺特异性抗原、睾酮、游离睾酮、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶分别用ELISA的双抗体夹心法进行检测[3-5],步驟如下:(1)将试剂盒从恒温冰箱中取出后在室温中放置15~30 min;(2)将酶标板取出后依次向空白微孔中加入标准品溶液,剂量为100 μL,空白对照组中则需要加入同等剂量的无菌蒸馏水;(3)在除去空白对照孔之外的各孔中加入酶标记溶液,剂量为50 μL;(4)采用封口胶将酶标板密封处理,在37 ℃条件下进行孵育,1 h后对酶标板进行反复5次冲洗,浓缩的洗涤液稀释比例为1∶100,稀释溶液为无菌蒸馏水,然后采用吸水纸将洗涤后的酶标板彻底排干;(5)依次向各孔中加入各50 μL的A和B溶液,室温避光条件下使其充分进行反应,时间为10 min,然后向各孔中加入终止液,剂量为50 μL,将反应终止。血清雌激素的检测用ELISA的竞争法检测[6],(1)配好标准品,稀释好样品(用样品稀释液1∶1稀释);(2)加50 μL EIA Buffer到B0孔中;(3)加50 μL各标准品到标准孔中;(4)加50 μL稀释好的样品到样本中;(5)加50 μL Estradiol Ache Tracer 到每孔中;(6)加50 μL Estradiol EIA Antiserum 到每孔中;(7)盖上覆膜,在振荡器里室温孵育1 h;(8)甩开孔里面的液体,用洗液冲洗5次;(9)加200 μL Ellmans Regent 到每孔中;(10)加5 μL Tracer 到每孔中;(11)盖上覆膜,避光,振荡器中室温孵育60~90 min;(12)揭开覆膜,酶标板测OD值。

1.6 病例切片

1.6.1 切片制作具体步骤 (1)脱水:将固定后的肺组织取出后采用梯度酒精进行脱水处理,梯度酒精的浓度为30%→50%→70%→80%→90%→95%→95%→100%→100%,各级处理的时间均为1 h。(2)透明:二甲苯和无水乙醇比例为1∶1,处理时间为30 min,然后单纯采用二甲苯处理8 min。(3)浸蜡:二甲苯和无水乙醇比例为1∶1,处理时间为30 min,然后给予石蜡三道浸蜡,1 h/次。(4)包埋:将熔化的石蜡倒入模具中,采用加热的镊子将经过浸蜡处理的组织块轻轻加入熔蜡中,将包埋盒改好并采用采用熔蜡填充凹槽,在室温下等待至凝固状态。(5)切片:将经过石蜡包埋后的组织连续切片,层厚为6 μm,完成后将其放入45 ℃水浴锅中烫平,以便能够将其贴在载玻片上,在烘片箱中(60 ℃)处理3 h。

1.6.2 免疫组化二步法检测各组瘤块雄性激素受体的表达情况 具体步骤:(1)石蜡切片脱蜡至水后依次加入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、无水乙醇Ⅰ,时间间隔均为15 min,然后依次加入无水乙醇Ⅱ、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸馏水,时间间隔均为5 min。(2)热抗原修复:放进0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液里,加热至95 ℃ 10 min,室温冷却。(3)PBS洗3次,持续时间为5 min/次,待水分甩干后,用免疫组化笔将组织圈起。(4)H2O2室温孵育,浓度为3%,时间为10 min。(5)PBS冲洗3次,持续时间为3 min/次。(6)滴加一抗(稀释比例为1∶100),室温孵育,时间为1~2 h,PBS冲洗3次,持续时间为2 min/次。(7)滴加试剂A,剂量为50~100 μL,室温孵育,时间为1 h,PBS冲洗3次,持续时间为2 min/次。(8)滴入DAB溶液显色,并在显微镜下观察。(9)PBS冲洗,持续时间为10 min,加入苏木精复染,2 min后加入盐酸酒精分色,完成后用自来水冲洗,持续时间为10~15 min。(10)脱水、透明、中性树胶封固。(11)光镜下对细胞形态进行观察。

1.7 统计学处理 使用SPSS 17.0统计软件进行分析,计量资料采用(x±s)表示,比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

比卡鲁胺给药1周后,实验组与对照组各项指标相关水平变化不大(P>0.05);比卡鲁胺用药2周后,实验组睾酮水平下降,4周后睾酮水平可见明显下降(P<0.05),其他指标未见明显变化(P>0.05),见表1,图1。给药4周后对照组雄性激素受体免疫组化平均灰度值(IOD)为(735±5),实验组为(531±6),两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

前列腺癌患者在实施抗雄激素治疗后常并发骨质疏松,在围绝经期妇女中发生骨质疏松的风险也明显增高[7]。研究显示,在前列腺癌患者最开始实施康雄激素治疗的几年内,平均每年骨密度下降水平为3%~5%,与此同时,此类患者的骨质疏松性骨折的发生风险也明显增加[8-10]。endprint

在一项小鼠去势模型和AR基因敲除模型对比的实验研究中可以明确了解雄激素对男性骨折的重要作用,与对照组相比较,去势实验小鼠的皮质骨厚度和松质骨量分别下降8%和71%[11-13],而AR基因敲除小鼠的皮质骨厚度和松质骨量分别下降13%和68%[14-16],证实雄激素在小鼠的松质骨量维持方面作用和重要,而雄激素和雌激素在小鼠皮质厚度维持方面的作用很重要。

人体骨量的多少主要取决于在相同的骨重建单位过程中骨吸收与骨形成的动态平衡,骨质疏松可以分为低转换型和高转换型,其中前者主要由成骨细胞介导,后者主要由破骨细胞介导[17]。骨代谢的生化标志物是股转换整体情况的重要标志。其中BALP半衰期较长,且具有良好的稳定性,是具有代表性的有效的骨形成代谢指标反映。有研究认为,对BALP定量测定或者动态观察中OP的早期诊断、疗效监测中提供有效的依据[18-20]。其中TRAPS5b的特异性是骨吸收指标中最高,不容易受到白天和夜晚变化的影响,并且也不会受到肝肾疾病的影响。

比卡鲁胺属于临床常用的雄激素受体的拮抗剂,能够导致雄激素丧失对前列腺细胞生长以及功能的调节作用,还能诱导细胞凋亡和抑制前列腺癌细胞生长,对骨质疏松的影响研究很少。本次实验研究通过建立动物模型,分别于给药不同时间,采集实验组及相应对照组裸鼠的血液及瘤体。对睾酮、雌性激素、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶分別用ELISA的双抗体夹心法进行检测并记录分析,骨质疏松相关指数变化不大。雄激素受体的拮抗剂(比卡鲁胺)可以影响睾酮的含量,对骨质的生化指标影响不大。

通过4周的实验,雄性激素受体抑制剂比卡鲁胺可以影响雄性大鼠的睾酮含量,对雌性激素含量不影响,同时对骨质疏松的生化指标不影响。或者时间短,影响不能体现,对此方面的研究需要更长期的努力。

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