碳点荧光探针的制备及其在食品分析中的应用

叶松龄+黄佳佳+罗林+傅慧君+孙远明+沈玉栋+雷红涛+徐振林

摘 要 碳点作为一种新型荧光碳纳米材料，具有优良的光学性能和小尺寸特性，以及良好的生物相容性、低毒性以及易于实现表面功能化等特点，是潜在的可以代替传统半导体量子点等荧光探针的良好选择。基于其独特的荧光特性和高灵敏度，碳点荧光探针在食品分析领域具有很好的应用潜力。本文对近年来荧光碳点的研究进展进行了综述，简述碳点的性能并对碳点的制备方法进行总结对比，重点介绍了碳点荧光探针在食品分析领域的应用，对目前碳点应用的限制进行了分析， 对其发展前景和展望。

1 引 言

熒光碳点（Carbon dots， CDs）是一种粒径小于10 nm且近似球型的零维荧光碳纳米粒子。碳点的首次发现是2004年Xu等[1]对电弧放电法产生的烟灰中的单壁碳纳米管进行分离纯化时的意外收获，在用凝胶电泳法处理单壁碳纳米管的悬浮液时发现，分子量不同的3组荧光纳米粒子，在紫外灯照射下分别发出蓝绿色、黄色和橘红色的荧光。经过后续一系列研究， 2006年Sun等[2]采用激光刻蚀的方法获得荧光性能较好的碳纳米粒子，并首次将其称为碳点。与传统半导体量子点相比，碳点不仅具有可与之媲美的荧光性能，且本身并不含有任何有毒重金属元素，具有低毒性和良好的生物相容性，易于实现表面功能化，因此一经发现便引起研究者的广泛研究兴趣。对碳点的研究重点集中在碳点的制备和应用两个方面，且更多是研究其在生物成像[3～5]、生化分析检测[6～8]和光电催化[9，10]等领域的应用，在食品分析检测领域方面的应用研究并不多，而实际上碳点作为荧光探针在食品分析检测中具有非常大的应用潜力。本文对碳点的制备及其在食品分析检测领域的应用进行了系统的综述，并对目前碳点应用的限制和发展进行了分析和展望。

2 碳点及其性能

碳点通常为球体或近球体结构，是一个三维团簇结构，其三个维度尺寸均在纳米尺度[11]，可以通过控制合成碳点的反应温度[12]、反应时间[13]等因素得到不同粒径大小的碳点，但这一形成机制目前并不明确[14]。碳点表面一般存在大量的亲水性官能团如羟基、羰基等，可稳定分散于水溶液中，更有利于表面修饰。由于独特的结构，与传统的半导体量子点相比，碳点具有独特的性能：（1）目前合成的荧光碳点大多在紫外区有强烈的光吸收，还可延伸至可见光区，一般位于270～320 nm处； （2）碳点具有宽而连续的激发光谱，与传统量子点一样，在单色光源激发下可以得到不同发射波长的荧光，即“一元激发多元发射”[2]，这为实现生物分子的多组分同时检测提供了可能[15，16]； （3）荧光稳定性高且耐光漂白，即使在持续激发光照射几个小时后其荧光强度也几乎没有降低[17]； （4）荧光强度可调性，可根据溶液pH值的变化而变化，且不同条件合成的碳点对pH响应也不同[18～20]； （5）具有光电荷转移特性，可作为优良的电子供体和电子受体[21， 22]； （6）部分碳点具有上转换发光（UCPL）性质，即在较长激发光的激发下，碳点发出较短波长荧光的现象[23， 24]，如Shen等[25]报道中的经PEG钝化后的碳点，在激发波长为600～800 nm时，上转换的发射波长移至390～468 nm； （7）除了光致发光性能，与半导体量子点相似，碳点还具有电化学发光的发光特性[26]。研究认为碳点的电致发光的荧光不受粒子尺寸和修饰剂的影响而更多是取决于表面态。碳点的ECL和PL机理如图1所示。

3 碳点的制备

自碳点被发现至今，其制备方法的研究一直是研究热点。目前已经建立了一系列碳点合成的方法，这些方法大体上可归纳为两大类：自上而下法（Topdown）和自下而上法（Bottomup）。

自上而下法主要是将碳的前驱体通过化学、电化学或者物理方法等使其从大变小，得到纳米尺度的碳点[33]，主要包括电弧放电法[1，34]、激光刻蚀法[2，35，36]、电化学氧化法[17，37，38]和化学氧化法[39～41]等。自下而上法通常以小分子为反应前驱体，大多是采用化学方法合成荧光碳点，主要包括模板法[42～44]、微波法[45～47]和水热合成法[48～50]等。以上方法得到的只是碳点粗产物，还需通过离心、透析或电泳等分离方法进行纯化。一般而言，自上而下法制得的碳点性能较好，但存在制备过程较复杂、部分仪器较为昂贵、荧光量子产率较低和收集困难等问题； 自下而上法所用碳源来源丰富，过程较简单，易于控制，荧光量子产率较高，但后续的分离纯化较困难，且对碳点性能有较大影响。目前，制备碳点方法以自下而上法较多，近年来微波法和水热法以其资源易得、过程绿色环保的特点更受研究者的青睐。典型的制备方法及其所得碳点的性能参数如表1和表2所示。

4 碳点在食品分析检测中的应用

与传统的半导体量子点一样，碳点通过与待测物的作用从而改变表面电子空穴对之间的复合效率，导致其荧光的增强或猝灭，从而实现对待测物的定性或定量分析[51]。由于碳点的低毒性、良好的生物相容性，以及优良的光学特性，以碳点作为荧光探针的分析方法具有高效简便、高灵敏度和选择性好等优点，在食品分析检测方面得到越来越广泛的重视和应用。

4.1 食品添加剂检测

食品添加剂的种类繁多，其滥用及超标或超范围使用问题也非常突出，因此对其进行定量分析检测十分必要。

Lin等[52]以甘油为碳源，PEG1500N为钝化剂，通过微波法处理得到表面经过丝氨酸修饰后的碳点，该碳点在亚硝酸盐和酸化的H2O2的作用下有强的发光，可用于定量检测样品中的亚硝酸盐。在1.0 ×10mol/L范围内，碳点的荧光强度变化与亚硝酸盐含量呈线性相关，并成功应用于牛奶中亚硝酸盐的测定。Yuan等[53]通过在空气中加热N羟乙基乙二胺三乙酸（HEDTA）制备得到发蓝色荧光的碳点，发现该碳点与日落黄之间存在荧光能量共振转移而使碳点发生荧光猝灭，由此可用于分析检测样品中日落黄的含量，碳点的荧光强度与日落黄的浓度在0.3～8.0 μmol/L 呈良好线性关系，检出限为79.6 nmol/L，并应用于软饮料样品中日落黄的测定。如图2所示，Xu等[54]将新鲜芦荟通过水热法处理得到的碳点能与柠檬黄相互作用形成基态复合物而导致荧光猝灭，该反应为静态猝灭过程。在0.25～32.50 μmol/L范围内碳点荧光信号变化与柠檬黄的浓度呈线性关系，检出限为73 nmol/L。该方法已成功用于玉米馒头、糖果和蜂蜜样品中柠檬黄含量的检测。近年来，荧光光谱检测技术已经逐步应用于食品添加剂检测领域并取得一定进展[55～58]，但结合碳点探针方法的报道仍较少，且研究的对象范围较狭窄，可以改良样品前处理方法，进一步提高该类方法的灵敏度和选择性。endprint

4.2 金属离子检测

一些常见金属离子，包括Al3+、Hg2+、Cu2+等，可通过食物链在人体内长期蓄积，从而对人体产生多方面的危害[59，60]。因此加强对食品中金属离子尤其是有毒重金属离子的检测是保证食品安全中重要措施。利用碳点与金属离子形成的“荧光猝灭”现象，可实现对金属离子的快速高灵敏检测。

Yan等[61]以柠檬酸为碳源，4，7，10三氧1， 13十三烷二胺为钝化剂，利用一步水热法制备可特异性识别Al3+的碳点，如图3所示，在4～40 μmol/L的范围内碳点的荧光强度与Al3+的浓度呈线性关系，检测限为0.0329 μmol/L，且几乎不受其它离子的影响， 采用此方法实现了对油条、馒头、薯条、面包等食品中Al3+的检测。Liu等[62]报道了一种新型荧光探针（NCNPs），并成功用于牛奶和海带样品中的Hg2+的检测。该探针是以柠檬酸为碳源、（NH4）3PO4为氮源，经过水热处理制备得到的一种氮掺杂碳点。碳点表面的NH或吡咯状NH与Hg2+之间有较其它金属离子更强的相互作用以引起荧光猝灭，从而实现对Hg2+的特异性检测，检出限为2.3 nmol/L。表面修饰后或复合型碳点能在复杂环境中对特定离子进行特异性检测[51]。Zhu等[63]使用天然海带作为碳源，通过水热法制备荧光碳点，并用聚乙烯亚胺（PEI）修饰碳点表面，成功用于检测酸奶样品中的Cu2+。利用碳点检测金属离子的过程中，多数情况是利用金属离子引起碳点的荧光内滤效应导致的荧光猝灭[64，65]。相对于传统检测方法，基于碳点探针方法的灵敏度和选择性都有较明显的优势，但从目前的研究来看，靶向金属离子的种类并不多，且可能由于实际处理样本较复杂而较少能运用到实际食品中的检测。近年来的研究发现，可以利用多种碳点组装的荧光传感器对多种金属离子进行同时检测。Gui等[66]基于碳点的上转换荧光，将聚亚乙基亚胺功能化的碳点和表面修饰有羧基的碳点组合，开发了一种新型荧光传感器，能够可逆和同时检测Cu2+和Hg2+，其中不同浓度的Cu2+和Hg2+的加入会分别引起465和600 nm处的荧光发射峰强度的线性变化，其检出限分别为0.05和0.08 mol/L。

4.3 食品营养成分分析

利用碳点表面电子转移产生的荧光猝灭的原理，可检测食品中具有金属络合物能力的营养成分。金属离子与碳点表面间的静电相互作用和发生电子转移使碳点的荧光猝灭。再根据被检测的物质与该金属离子有更强的络合作用从而破坏“金属离子碳点”体系，使碳点的荧光恢复， 最终实现对目标物的定量检测。

谷胱甘肽（Glutathione， GSH）广泛存在于动植物和微生物中，对维持机体适宜的氧化还原环境起到至关重要的作用[67]。Xu等[68]利用柠檬酸钠和尿素通过水热法制备得到碳点，加入Hg2+后与碳点表面间发生电子转移， 使碳点发生明显的荧光猝灭，在体系中加入对Hg2+有更强络合作用的GSH后，碳点荧光恢复，形成对GSH的“Offon”型荧光探针，检出限达到37 nmol/L。该探针被成功应用到西红柿、圣女果、葡萄、黄瓜和菠菜等果蔬样品中GSH的检测。Hg2+还可以被较低毒性的Cu2+代替[69]，同样可以实现对食品中GSH的高效检测。Purbia等[70]用微波辅助水热法合成的碳点与Cu2+形成荧光探针，用于维生素B1的检测，如图4所示，Cu2+的加入使碳点荧光猝灭，加入维生素B1后， 通过共价键作用与Cu2+结合，使其从碳点表面脱离从而使碳点荧光恢复。 该方法检测维生素B1的灵敏度高、抗干扰性强，检出限为280 nmol/L，线性范围10～50 μmol/L。由于食品的多样性和食品营养成分组成的复杂性，样品的基质效应对检测结果的准确性有较大的影响，因此需要选择恰当的前处理方法，开发具有更好稳定性和选择性的碳点材料用于检测。

4.4 食源性致病菌检测

近年来，在世界范围内因食源性疾病导致的食品安全突发事故时有发生，而食源性致病菌是其主要诱因，常见的致病菌有沙门氏菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌等[71，72]。

夏圣等[73]将抗沙门菌Ha因子抗体偶联碳点CDs制备免疫纳米荧光碳点，可有效结合抗O4磁珠富集的细菌，分离后，通过测定荧光光谱分析样品中乙型副伤寒沙门氏菌的污染情况。结果表明，该方法对乙型副伤寒沙门氏菌的检测限为103 CFU/mL，检测时间约为2 h。Weng等[74]以柠檬酸铵为碳源通过加热的方法制备碳点，发现甘露糖修饰的碳点由于甘露糖与大肠杆菌的凝集素单位的选择性结合而能够对大肠杆菌进行特异性标记和检测，如图5所示，并成功应用于自来水、苹果汁、人尿液等实际样品中大肠杆菌的检测。应用碳点荧光探针对食源性致病菌的检测方法中，寻找合适的表面配体是关键之一，既能与碳点牢固结合，在保证碳点的化学和光学性能稳定的同时，又能保证同目标物的有效结合。阿米卡星是一种常见的氨基糖苷类抗生素，Chandra等[75]将其作为大肠杆菌的结合配体，与水热法合成的碳点结合形成荧光探针用于检测大肠杆菌，其荧光强度与大肠杆菌的浓度在3.9×105～7.6×102 CFU/mL的范围内呈线性关系，检出限为552 CFU/mL，并且成功应用于不同果汁样品（如苹果汁、菠萝汁和橙汁）中大肠杆菌的检测。

4.5 有机污染物检测

农兽药的广泛使用，自然环境和生产加工过程中的污染等，均可造成食品中的有害有机物污染，严重威胁食品安全。近几年，已经建立了多种基于碳点荧光探针的检测方法，包括荧光测定法、免疫分析法、电化学传感器法等方法。 Chang等[76]制备了能发射强烈黄色荧光的碳点，423 nm激发时，最大发射波长为 524 nm， 农药对氧磷可以浓度依赖的方式对该碳点的荧光猝灭，检出限为（0.22±0.02） μmol/L， 并成功用于白菜样品中的对氧磷检测。除了常用的基于荧光猝灭的方法，还可以与分子印迹等方法结合开发灵敏度更高和选择性更好的传感器，进一步拓展其应用。Li等[77]开发一种由分子印迹聚合物（Molecularly imprinted polymers， MIPs）和适配体组成的双识别系统的生物传感器，其中MIPs是将碳点标记的DNA适配体与林可霉素和邻氨基苯酚通过电聚合的方法在由氧化石墨烯修饰的电极上合成的。该方法实现对林可霉素的双重识别，具有高的灵敏度，检出限为1.6 ×10mol/L， 并成功應用于鸡肉、牛肉等多种肉类样品中林可霉素的检测，但稳定性仍需进一步改进。这些检测方法可对食品中有害有机污染物进行快速灵敏的检测，典型方法如表3所示。

5 总结与展望

碳点作为一种新型纳米材料，因其突出的荧光性能、低毒性和生物相容性的特点，在食品安全领域得到了越来越广泛的研究，具有良好的应用潜力。然而，对于碳点的开发利用仍处于初级研究阶段，其荧光机理尚不十分明确。在合成制备方面，碳源的选择呈现多样性且方法趋于灵活简便，但多数仍处于实验室阶段，对碳点后续纯化的步骤往往比较繁琐和耗时，且会对碳点的荧光量子产率和荧光活性有较大的影响。在食品分析应用方面，从目前的报道可看出碳点在该领域有很大的应用潜力； 由于食品组成成分的复杂性，仍存在较多有待解决的问题，例如检测的特异性不强而灵敏度也有待提高，而且现建立的方法检测的多是单一目标物，对于同时检测多个目标物的报道非常少，需进一步的研究和开发。

因此，选择合适的碳源和对合成工艺的优化，以达到降低生产成本，提高产率、化学稳定性和重现性是实现碳点大规模应用的关键。在后续的掺杂或表面功能化应用中，与其它方法（如免疫分析、电化学传感器、分子印迹聚合物等方法）的联用会进一步拓宽应用范围，提高方法的灵敏度、准确度以及特异性，这是碳点的一个重要发展方向。近年来，免疫分析方法、传感器等技术在食品安全检测领域的应用不断拓展，将碳点与免疫分析、传感器等方法结合，有望为食品安全监管提供有效的新技术和新方法。endprint