不同配方制备紫檀芪纳米乳液及其稳定性

2017-11-21 10:28,,,
食品工业科技 2017年21期
关键词:紫檀油相乳化剂

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(江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122)

不同配方制备紫檀芪纳米乳液
及其稳定性

刘钱媛,陈静静,张涛,江波*

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122)

以葵花籽油、橄榄油和中链脂肪酸甘油三酯(MCT)为载体油相,以吐温80(Tween 80)和酪蛋白酸钠(SC)为乳化剂,采用高压均质法制备紫檀芪纳米乳液(pterostilbene nanoemulsions,PTSNE)。研究了油相种类和质量分数、乳化剂类型和质量分数以及添加助乳化剂(甘油)对PTSNE粒径大小的影响。同时考察了环境因素pH(3~9)、热处理(40~100 ℃,60 min)和离子强度(0~500 mmol/L NaCl,0~500 mmol/L CaCl2)对PTSNE稳定性的影响。结果表明:不同载体油相制备的PTSNE粒径大小为:葵花籽油≈橄榄油>MCT,随着油相质量分数升高达到20%时,粒径变大,且储藏稳定性变差。不同乳化剂制备的PTSNE粒径大小为:Tween 80

紫檀芪,纳米乳液,稳定性,影响因素

图1 PTSNE制备的工艺流程图Fig.1 The flowchart of the preparation of PTSNE

紫檀芪(3,5-二甲氧基-4′-羟基二苯乙烯,pterostilbene)是主要来源于葡萄、蓝莓、紫檀木、花榈木和龙血树等[1-5]植物的天然活性化合物。近年来的研究表明,紫檀芪能够改善血液胆固醇水平、预防糖尿病、抗癌、抗氧化、抗菌、抗炎和抗辐射等[6-12]。与同样是具有1,2-二苯乙烯结构的芪类化合物[13]白藜芦醇相比,紫檀芪的生物利用率要高出4倍,白藜芦醇和紫檀芪的生物利用率分别为20%和80%[14]。白藜芦醇的水溶性大,会随血液进入肝脏被迅速代谢分解并排出体外;而紫檀芪的脂溶性更好,可吸收进入小肠后随淋巴循环被运送到各器官,在体内停留时间长[14]。紫檀芪近年来在医药、食品和保健品等领域备受关注,David Stipp在《美国科学人》杂志中发文将其誉为“下一代白藜芦醇”,然而紫檀芪的水溶性差,因此其应用受到了一定的限制。

为了改善紫檀芪的溶解性和生物利用率,Zhang Y等人[5]和Sun Y等人[15]均使用纳米乳液体系来包埋紫檀芪形成纳米乳液药物递送系统。纳米乳液通常是一种液相以液滴形式分散于另一相中,其液滴比较均匀且液滴尺寸比较小,通常在几十纳米至几百纳米的范围内[16-17]。水包油纳米乳液能够高效包埋脂溶性药物增加其溶解度。而且对于包埋的药物来说,纳米乳液能使其隔绝空气和光,纳米乳液也极大程度地保护了药物的氧化和分解等,同时大量研究表明纳米乳液运载体系能增加脂溶性药物的生物利用率[18-19]。纳米乳液作为水不溶性活性分子以及药物成分运载体系已经广泛应用于食品及医药领域,解决其水溶性差、化学性质不稳定、生物利用率低等问题。

本研究将紫檀芪溶解于油相中,通过高压均质法制备出包埋紫檀芪的纳米乳液,以改善紫檀芪的溶解性和生物利用率。选择葵花籽油、橄榄油、中链脂肪酸甘油三酯(MCT)作为三种不同种类的油相,以吐温80(Tween 80)和酪蛋白酸钠(SC)作为两种不同种类的乳化剂,经高速剪切和高压均质制备出紫檀芪纳米乳液(pterostilbene nanoemulsions,PTSNE),分析了不同配方参数对纳米乳液性质的影响。对于商业产品来说,食品体系在制备、保藏到食用过程中可能会接触到不同的pH、温度及离子强度,且在该过程中需保持良好的理化稳定性,因此本文研究了PTSNE的pH稳定性、温度稳定性和盐离子稳定性,以期制备出一种理化性质稳定的紫檀芪纳米乳液运载体系,为提高紫檀芪稳定性、溶解性和生物利用率进一步提供技术基础。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

紫檀芪(纯度≥99.8%) 杭州瑞树生化有限公司;福临门葵花籽油 当地超市;中链脂肪酸甘油三酯(medium chain triglycerides,MCT) 丰益油脂化学(连云港)有限公司;酪蛋白酸钠(sodium caseinate,SC) 东京化成工业株式会社;橄榄油、吐温80(Tween 80)、甘油、氯化钠、氯化钙、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲醇 国药集团化学试剂公司。

Ultra-Turrax T25 digital高速分散器 德国IKA公司;Zetasizer nano ZS纳米粒度及Zeta分析仪 英国马尔文仪器有限公司;FE20 pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司;AH-Basic高压均质机 ATS有限公司;Waters e2695(配备2489紫外检测器)高效液相色谱仪 美国Waters公司。

1.2实验方法

1.2.1 PTSNE的制备 按照毛立科等[20]的方法并加以修改制备了PTSNE,制备的工艺流程图如图1所示,具体制备方法如下:

油相的制备:1%(质量分数,下同)紫檀芪粉末溶解于油相(葵花籽油、橄榄油、MTC)中,加热搅拌至充分溶解;水相的制备:将一定质量分数的乳化剂(Tween 80、SC)溶解于PBS缓冲液(10 mmol/L,pH7.0)中;粗乳液的制备:将一定质量分数的油相和一定质量分数的水相混合,使用高速分散器在10000 r/min转速下高速剪切3 min得到粗乳液;纳米乳液的制备:将粗乳液5次通过高压均质机,均质压力为50 MPa,得到水包油紫檀芪纳米乳液。

1.2.2 不同配方参数对PTSNE的影响

1.2.2.1 油相种类和质量分数 为了探究油相的种类和质量分数对PTSNE的影响,使用了葵花籽油、橄榄油、MCT作为油相,均选用了质量分数为2.5%、5%、10%、20%的油相,因此对应的水相质量分数分别为97.5%、95%、90%、80%,水相为1%的Tween 80溶解于PBS缓冲液中。水相和油相混合后,经高速剪切、高压均质(条件同1.2.1 PTSNE的制备),得到相应的纳米乳液。

1.2.2.2 乳化剂类型和质量分数 水相中的乳化剂(Tween 80、SC)质量分数分别为1%、2%、3%、4%、5%,油相(葵花籽油)质量分数为10%,水相质量分数为90%。水相和油相混合后,经高速剪切、高压均质(条件同1.2.1 PTSNE的制备),制备得到相应的纳米乳液。

1.2.2.3 助乳化剂(甘油)质量分数 乳化剂(Tween 80、SC)质量分数为1%,分别添加质量分数为10%、20%、30%、40%、50%的甘油至水相中,油相(葵花籽油)质量分数为10%,水相质量分数为90%。水相和油相混合后,经高速剪切、高压均质(条件同1.2.1 PTSNE的制备),制备得到相应的纳米乳液。

1.2.3 PTSNE理化性质分析

1.2.3.1 纳米乳液中紫檀芪包封率的测定 取1 mL制备的紫檀芪纳米乳液,加入1 mL乙酸乙酯进行萃取,重复萃取3次后合并萃取液,将萃取液稀释后进行HPLC分析,测定紫檀芪含量。色谱条件:色谱柱为C18柱;流动相为甲醇∶水(60∶40),流速为1.0 mL/min;紫外检测器,305 nm下检测;进样量10 μL;柱温35 ℃。包封率(Encapsulation efficiency)使用下面公式进行计算[21]:

式(1)

式(1)中:m1为使用HPLC测得的新鲜制备的乳液中紫檀芪的含量,mg;m0为该乳液体系均质前添加到其中的紫檀芪的含量,mg。

1.2.3.2 粒径和电位分析 将制备的PTSNE用PBS缓冲液(与纳米乳液的pH相同)稀释100倍,以避免多重散射的影响,采用纳米粒度及Zeta电位分析仪测定纳米乳液的粒径大小和电位,仪器设定散射光角度为173°,测定温度为25 ℃。测得的粒径数据表示的是纳米颗粒的平均液滴粒径大小(Z-average),电位相关数据用Zeta电位值(ζ-potential)来表示,PDI(Poly dispersity index,多分散性指数)值表示乳液的均一程度。

1.2.3.3 pH稳定性 10%的油相(葵花籽油)和90%的水相混合,乳化剂(Tween 80、SC)质量分数为1%,将制备好的纳米乳液分装于试管中,使用1 mol/L NaOH或者1 mol/L HCl溶液调节pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,在室温放置过夜,稀释100倍后,测定纳米乳液的粒径和Zeta电位值。

1.2.3.4 温度稳定性 10%的油相(葵花籽油)和90%的水相混合,乳化剂(Tween 80、SC)质量分数为1%制备纳米乳液。取10 mL纳米乳液于试管中,分别在40、50、60、70、80、90、100 ℃下水浴保温60 min,在室温放置过夜,稀释100倍后,测定纳米乳液的粒径和Zeta电位值。

1.2.3.5 盐离子稳定性 10%的油相(葵花籽油)和90%的水相混合,乳化剂(Tween 80、SC)质量分数为1%制备纳米乳液。用不同浓度的盐溶液(NaCl溶液、CaCl2溶液)稀释乳液,形成一系列具有相同液滴浓度的,但具有不同盐浓度的样品。最终乳液中盐离子浓度分别为0、50、100、200、300、400、500 mmol/L。室温下200 r/min搅拌过夜,稀释100倍后,测定纳米乳液的粒径和Zeta电位值。

1.3数据处理

所有实验至少进行3次平行并采用平均值,使用Microsoft excel软件进行数据处理,采用SPSS 22.0软件对实验数据进行分析,使用Tukey法进行差异显著性分析(p<0.05)。

2 结果与讨论

2.1油相种类和质量分数的影响

纳米乳液的主要组成相之一是油相,水与油互不相溶,在乳化剂的稳定作用下均质时一相会以液滴形式较稳定地分散于另一相中,油相的种类和质量分数都会在一定程度上影响着纳米乳液的稳定性。同时研究表明,油相的种类和质量分数会影响包埋的活性物质的生物利用率[22]。表1所示的是三种不同油相制备的PTSNE的基本理化性质。图2表示的是不同油相种类和质量分数对PTSNE平均粒径影响,以及PTSNE在37 ℃的情况下储藏30 d后的稳定性情况。

从图2中可以看出,随着油相质量分数的增加,PTSNE平均粒径增大。当油相质量分数为2.5%、5%、10%,粒径变化幅度较小,当质量分数达到20%时,粒径均增大50 nm左右。而且经MCT制备的纳米乳液,在37 ℃的情况下储藏了30 d后,当油相质量分数达到20%时,出现油水相分层现象(未显示)。其他三种油相浓度,储存30 d后粒径没有明显变化,乳液体系仍然稳定。油相用来溶解脂溶性营养素,所以油相的质量分数越大,载药量更大[23]。但是油相质量分数太高时,乳化剂吸附层在油水界面会吸附过多的油滴,从而会导致液滴的凝聚现象发生[24]。所以在后续实验中,选择10%的油相既能保证其粒径较小,稳定性更好,也能包埋更多的紫檀芪。同时,从不同油相种类制备的纳米乳液的粒径变化可看到,长链脂肪酸大于中链脂肪酸,脂肪酸链长越长,形成的乳液粒径相应越大。MCT形成的纳米乳液粒径小于其他两种油相制备的纳米乳液的粒径。

图2 油相种类和质量分数对PTSNE平均粒径的影响Fig.2 Influence of the type and concentration the oil on the mean droplet diameter of PTSNE

表1 紫檀芪纳米乳液的基本理化性质Table 1 Physico-chemical characteristics of PTSNE

2.2乳化剂类型和质量分数的影响

食品工业中的乳化剂主要有两种类型:小分子乳化剂(如Tween 80、单甘酯、卵磷脂等)和大分子乳化剂(蛋白质和多糖等)[25]。通常情况下,乳化剂的质量分数对液滴平均粒径的影响在均质过程中可分为两个阶段:第一阶段,在该范围内,随着乳化剂质量分数增加,液滴尺寸逐渐减小,因为没有足够的乳化剂覆盖在新形成的液滴表面;第二阶段,液滴尺寸保持相对恒定,因为有足够多的乳化剂覆盖到所有形成的液滴的表面[26-27]。如图3表示的是不同乳化剂种类和质量分数对PTSNE平均粒径影响。

从图3中可得出,随着乳化剂质量分数升高,2种不同乳化剂(Tween 80、酪蛋白酸钠)制备的PTSNE的平均液滴粒径均显著减小(p<0.05)。这是因为在较高乳化剂浓度时,均质过程中更多的乳化剂能覆盖在油分子表面,乳化剂能更快的吸附到油水界面,可防止液滴间重新聚合[28]。在高乳化剂浓度时,液滴粒径变化不大,这可能是由于受到了均质时提供的能量的限制[29]。在相同乳化剂浓度下,Tween 80制备出的乳液粒径明显小于SC制备的乳液粒径。这是由于Tween 80为小分子类型乳化剂,分子结构较为紧凑且空间位阻作用小,在油水界面较容易形成致密的乳化剂层,同时吸附到油水界面速率快,迅速降低界面张力,促进小液滴的形成[30];而酪蛋白酸钠为大分子乳化剂,吸附速率相对较慢。

图3 乳化剂类型和质量分数对PTSNE平均粒径的影响Fig.3 Influence of the type and concentration of the emulsifier on the mean droplet diameter of PTSNE

根据乳化剂添加的质量分数为0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的粒径变化情况综合来看,后续实验中选取质量分数为1%的Tween 80和SC来制备纳米乳液考察其稳定性。

2.3助乳化剂(甘油)对纳米乳液平均粒径的影响

食品级的纳米乳液其乳化剂属于添加剂,使用量有一定的限制,不能超过规定的最大口服量,为了在比较少的乳化剂使用量下制备更稳定的纳米乳液,可以添加适当的助乳化剂,例如甘油,以形成更稳定的纳米乳液[31]。研究表明,助乳化剂能改变连续相的物化性质(如介电常数、折射率、密度、界面张力),从而会改变液滴之间的胶体相互作用大小与范围(如范德华力、静电、疏水力)[32]。图4表示的是助乳化剂(甘油)对纳米乳液平均粒径的影响。

图4 甘油质量分数对PTSNE平均粒径的影响Fig.4 Influence of glycerol concentration on the mean droplet diameter of PTSNE

如图4所示,随着添加的甘油质量分数的增大,纳米乳液的粒径有所减小(p<0.05)。这是由于甘油的添加会增加水相的黏度,从而使得均质过程中的压强增加,对液滴的作用力增大[23]。同时,水相的黏度增加降低了液滴间的碰撞频率,减缓了液滴因碰撞而发生的重新聚合,从而形成的纳米乳液更加稳定且粒径也有所减小[33]。

2.4pH稳定性

图5表示的是不同pH对Tween 80制备的PTSNE平均粒径的影响。如图5所示,Tween 80为乳化剂时,在不同pH环境中其粒径基本无变化,这是由于Tween 80是非离子型乳化剂,其本身的分子结构受pH影响小,且稳定乳液的原理是通过较强的空间排斥力(而不是静电斥力),所以形成的纳米乳液其pH稳定性好。

图5 不同pH对Tween 80制备的PTSNE平均粒径的影响Fig.5 Influence of pH on the mean droplet diameter of PTSNE stabilized by Tween 80

图6显示的是不同pH对SC制备的PTSNE平均粒径的影响。蛋白类乳化剂稳定的纳米乳液主要依靠静电斥力,因此其稳定性易受溶液pH的影响[34]。从图6可看到,在pH4、pH5时,乳液的粒径值增加到大于1000 nm,而且乳液液滴发生聚集。由于该pH靠近酪蛋白酸钠的等电点(pH4.6)[35],会造成体系的电位的降低,因此液滴之间的静电斥力降低,不足以克服相互吸引力(范德华力和疏水相互作用力),从而造成液滴聚合。

图6 不同pH对SC制备的PTSNE平均粒径的影响Fig.6 Influence of pH on the mean droplet diameter of PTSNE stabilized by SC

图7 不同pH对SC制备的纳米乳液的ζ-电位的影响Fig.7 Influence of pH on the ζ-potential of PTSNE stabilized by SC

2.5温度稳定性

图8 热处理对PTSNE平均粒径的影响Fig.8 Influence of thermal treatment on the mean droplet diameter of PTSNE

图8表示的是PTSNE在热处理(40~100 ℃,60 min)条件下的稳定性情况。温度变化可以通过多种机制影响乳状液的稳定性。首先,加热会导致液滴碰撞频率的增加,促进液滴间的聚集。同时,加热也会导致乳化剂分子构象的变化,可能会造成液滴聚集及乳液失稳[36]。例如,前人研究表明,对于球状蛋白质稳定的乳液,在热处理过程中或许会变得不稳定,因为球状蛋白质在加热过程中会展开,从而增加疏水相互作用以及形成二硫键,促进液滴的聚集。但是,这种现象对于酪蛋白酸钠不太适用[37]。如图8所示,在热处理(40~90 ℃,60 min)环境下,两种乳化剂制备的纳米乳液粒径大小基本无变化,而且在热处理之后也没有出现相分离的现象。SC制备的PTSNE在40~100 ℃的热处理过程中保持较稳定状态,平均粒径基本无变化,这是由于酪蛋白是无规则蛋白且缺乏半胱氨酸基团,很难通过疏水吸引力或二硫键促进液滴聚集[36,38]。Tween 80为乳化剂在100 ℃热处理时,其粒径发生了增大,这是可能是因为Tween 80在高温下发生了一定的降解,导致了部分液滴的聚集。

2.6离子强度稳定性

如图9所示,NaCl溶液对PTSNE平均粒径的影响。在使用盐离子处理纳米乳液之前,Tween 80和SC制备的纳米乳液粒径的平均液滴粒径分别约为200 nm和250 nm。Tween 80为乳化剂的纳米乳液随着NaCl和CaCl2溶液离子强度的增加,其液滴平均粒径变化很小,这是因为乳化剂稳定乳液主要是由于其空间斥力,而不是静电相互作用。所以离子强度对Tween 80制备的纳米乳液的稳定性影响较小。然而,使用酪蛋白酸钠乳化剂的乳液在NaCl≥50 mmol/L时,粒径增加到约280 nm。图10表示的是,不同CaCl2浓度对PTSNE稳定性的影响。从图片中可以看出,当CaCl2浓度大于等于50 mmol/L时,乳液出现聚沉现象,下层呈水相,上层为絮凝状;且随着CaCl2浓度的增加,相分离愈加明显,当CaCl2处理浓度为500 mmol/L时,乳液失稳分层现象更加严重。这是由于离子强度使得酪蛋白间的静电排斥力降低,诱发纳米液滴的聚沉或者絮凝。CaCl2溶液对乳液稳定性的影响比NaCl溶液大,更容易使乳液失稳。

图9 NaCl浓度对PTSNE平均粒径的影响Fig.9 Influence of NaCl concentration on the mean droplet diameter of PTSNE

图10 CaCl2浓度对PTSNE稳定性的影响Fig.10 Influence of CaCl2 concentration on the stability of PTSNE

3 结论

通过高压均质法制备了PTSNE,研究了不同配方参数(油相种类和质量分数、乳化剂种类和质量分数、助乳化剂的添加)对纳米乳液粒径大小及电位的影响,发现油相含有的脂肪酸链长越长,形成的乳液粒径相应越大,三种载体油制备的PTSNE粒径大小为:葵花籽油≈橄榄油>MCT,且随着油相质量分数增加粒径变大;小分子乳化剂(Tween 80)制备的PTSNE粒径小于蛋白类乳化剂(SC)制备的乳液粒径,且随着乳化剂质量分数升高,粒径均显著减小;在水相中添加助乳化剂(甘油)后,PTSNE粒径显著减小。同时考察了PTSNE的pH稳定性、温度稳定性和盐离子强度稳定性。结果表明:Tween 80制备的PTSNE在pH(3~9)、热处理(40~90 ℃,60 min)和离子强度(0~500 mmol/L NaCl,0~500 mmol/L CaCl2)环境下均有良好的稳定性。SC制备的PTSNE具有较好的温度稳定性,但在其等电点(pH≈4.6)附近和高离子强度(≥50 mmol/L CaCl2)环境下出现明显的液滴聚集现象。由此可见,小分子乳化剂Tween 80制备的纳米乳液具有较好的理化稳定性;大分子蛋白类乳化剂SC制备的纳米乳液在等电点附近的pH内以及高离子强度其稳定性不好。因此,对于蛋白类的乳化剂其pH及离子强度稳定性有待提高。本研究为紫檀芪及其他脂溶性营养素的纳米乳液运载体系的合理设计提供了重要的信息,对提高紫檀芪及食品中脂溶性营养素的稳定性、溶解性及生物利用率具有实际意义。

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Preparationofpterostilbenenanoemulsionswithdifferentformulationanditsstability

LIUQian-yuan,CHENJing-jing,ZHANGTao,JIANGBo*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Pterostilbene nanoemulsions(PTSNE)were prepared by high-pressure homogenization using sunflower oil,olive oil and medium chain triglycerides(MCT)as carrier oil phase,Tween 80 and sodium caseinate(SC)as emulsifiers. The influence of the type and concentration of the oil phase,the type and concentration of the emulsifier and co-emulsifier on the droplet diameter of PTSNE were investigated. The influence of pH(3~9),thermal treatment(40~100 ℃,60 min)and ionic strength(0~500 mmol/L NaCl,0~500 mmol/L CaCl2)on the physical stability of the emulsions were examined. The results showed that the droplet diameter of PTSNE depended on the type of the oil phase:sunflower oil ≈ olive oil>MCT. The droplet size became larger,and the storage stability became worse with the increase of the concentration of the oil phase up to 20%. The droplet diameter also depended on the type of the emulsifier:Tween 80

pterostilbene;nanoemulsion;stability;factor

2017-03-29

刘钱媛(1994-),女,硕士研究生,研究方向:食品加工新技术,E-mail:18352538094@163.com。

*

江波(1962-),男,博士,教授,研究方向:食品科学,E-mail:18352538094@163.com。

TS201.1

A

1002-0306(2017)21-0069-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.014

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