乳酸菌发酵蛋壳粉制备液态饲料添加剂的研究

苏 亮,温佳奇,游 颖,胡书蒙,刘梦杨,马 静,王玉华

(吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118)

乳酸菌发酵蛋壳粉制备液态饲料添加剂的研究

苏 亮,温佳奇,游 颖,胡书蒙,刘梦杨,马 静,王玉华

(吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118)

我国作为禽蛋生产大国，消费者对蛋制品的需求量逐年上升，导致每年有大量的蛋壳产生，这些蛋壳在我国的利用率较低，大部分被废弃，既造成资源的浪费又污染环境。以蛋壳为原料，利用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)发酵制备饲料添加剂，采用正交试验的方法对葡萄糖、玉米浆、接种量和蛋壳粉四种培养基的组分进行优化，得出最佳添加量。利用Box-Behnken试验设计，响应面法对发酵温度、发酵时间和摇床速率进行优化，得出最佳发酵工艺。结果表明：葡萄糖添加量6%、玉米浆添加量5%、接种量7%、蛋壳粉添加量7%、发酵温度37℃、发酵时间40 h，摇床速率150 r/min，发酵液中L-乳酸钙含量为89.68 g/L。

乳酸菌；蛋壳粉；L-乳酸钙；饲料添加剂

我国蛋壳年产量已突破300万t。目前仅有少量蛋壳通过简单处理用作肥料、土壤调节剂和动物饲料添加剂等[1]，产品附加值低。大部分蛋壳被废弃，造成资源浪费和严重的环境污染[2]。

蛋壳的主要成分是碳酸钙，同时含有1%左右的碳酸镁，3.2%的磷酸钙和磷酸镁及2.8%的有机物[3]。以蛋壳为原料制备的蛋壳粉含钙36%～37%、磷0.15%，可以满足畜禽对钙磷的需要[4]，常被用作动物饲料添加剂。Chang[5]发现：以碳酸钙和蛋壳粉作为饲料添加剂添加到小鼠日粮中，对比小鼠的骨骼生长和骨钙含量等情况，发现蛋壳粉都要好于碳酸钙。另外，在猪的日粮中添加2%的蛋壳粉，有利于钙磷比例的调整和获得必要的微量元素等[6]，羊、牛饲料中添加1%的蛋壳粉，可使体重快速增加并使产奶量增高。蛋壳粉添加到产蛋鸡日粮中，可提高产蛋率，延长产蛋期[7]。但是蛋壳中的碳酸钙为无机钙，不易被机体吸收利用，造成了钙元素浪费。因此，目前研究人员重点研究有机酸钙制剂，如乳酸钙、葡萄糖酸钙、醋酸钙等[8]。王继华等[9]通过比较甲酸钙、乳酸钙、柠檬酸钙及柠檬酸对仔猪生长性能的影响，发现乳酸钙对仔猪的促生长作用最好。以蛋壳粉为原料制备有机酸钙的方法主要有：微生物发酵法、高温煅烧法和直接中和法[10]。微生物发酵法因其具有耗能低、节约成本、操作简单等优点，更适用于生产制备乳酸钙[11]。常用的微生物是乳酸菌，乳酸菌可以利用糖类发酵产生乳酸，包括D-乳酸、L-乳酸及D,L-乳酸。其中L-乳酸可以在机体内完全降解为CO2和水，不会造成酸中毒。鼠李糖乳杆菌代谢属同型发酵，且其代谢产物为L-乳酸,所以本研究采用鼠李糖乳杆菌发酵蛋壳粉制备饲料添加剂。

1 材料和方法

1.1材料

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、葡萄糖、玉米浆(含有可溶性蛋白、生长素和一些前体物质)、MRS培养基、钙指示剂、硫酸镁(MgSO4)、氢氧化钠(NaOH)、盐酸(HCl)等。

1.2方法

1.2.1鸡蛋壳预处理

将收集来的鸡蛋壳，用粉碎机粉碎过筛后，马弗炉900℃煅烧2 h，得到鸡蛋壳粉末装瓶备用。

1.2.2L-乳酸钙含量的测定

1.2.2.1测定方法

取发酵液2 ml，滴加到250 ml锥形瓶中，加入50 ml蒸馏水、2 ml镁溶液、5 ml 20%NaOH溶液、2 ml HCl溶液(1+4)和10 mg钙指示剂，摇匀后，用EDTA标准溶液滴定，记录EDTA消耗量。测定平行样，取平均值。

1.2.2.2乳酸钙含量计算

W=C1×V2×308.3/2，

式中，W为L-乳酸钙含量，g/L；C1为EDTA标准溶液浓度，mol/L；V2为发酵液消耗EDTA溶液体积，ml；308.3为L-乳酸钙摩尔质量，g/mol。

1.2.3发酵单因素试验

分别对葡萄糖添加量(A)、玉米浆添加量(B)、接种量(C)、蛋壳粉添加量(D)、发酵温度(X1)、发酵时间(X2)、摇床速率(X3)7个因素进行单因素试验，以L-乳酸钙含量为指标，选取试验最优值。

1.2.3.1葡萄糖添加量单因素试验

以0.1 L蒸馏水为发酵体系，葡萄糖添加量分别为2%、4%、6%、8%、10%、玉米浆添加量为7%、蛋壳粉添加量3%，灭菌后接入菌液3%、120 r/min，37℃下发酵48 h，EDTA法检测L-乳酸钙含量。

1.2.3.2玉米浆添加量单因素试验

以0.1 L蒸馏水为发酵体系，葡萄糖添加量6%、玉米浆添加量分别为1%、3%、5%、7%、9%、蛋壳粉添加量为3%，灭菌后接入菌液3%，120 r/min，37℃下发酵48 h，EDTA法检测L-乳酸钙含量。

1.2.3.3接菌量单因素试验

以0.1 L蒸馏水为发酵体系，葡萄糖添加量6%、玉米浆添加量5%、蛋壳粉添加量5%，灭菌后接入1%、3%、5%、7%、9%的菌液，120 r/min，37℃下发酵48 h，EDTA法检测L-乳酸钙含量。

1.2.3.4蛋壳粉添加量单因素试验

以0.1 L蒸馏水为发酵体系，葡萄糖添加量6%、玉米浆添加量5%、蛋壳粉添加量分别为1%、3%、5%、7%、9%，灭菌后接入菌液5%，120 r/min，37℃下发酵48 h，EDTA法检测L-乳酸钙含量。

1.2.3.5摇床速率单因素试验

以0.1 L蒸馏水为发酵体系，葡萄糖添加量6%、玉米浆添加量5%、蛋壳粉添加量5%，灭菌后接入5%的菌液，摇床速率分别为40、80、120、160、200 r/min，37℃下发酵48 h，EDTA法检测L-乳酸钙含量。

1.2.3.6发酵温度单因素试验

以0.1 L蒸馏水为发酵体系，葡萄糖添加量6%、玉米浆添加量5%、蛋壳粉添加量5%，灭菌后接入5%的菌液，摇床速率120 r/min，分别在31、33、35、37、39℃下发酵48 h，EDTA法检测L-乳酸钙含量。

1.2.3.7发酵时间单因素试验

以0.1 L蒸馏水为发酵体系，葡萄糖添加量6%、玉米浆添加量5%、蛋壳粉添加量5%，灭菌后接入5%的菌液，摇床速率120 r/min，37℃下分别发酵16、24、32、40、48 h，EDTA法检测L-乳酸钙含量。

1.2.4正交试验优化发酵培养基组分

结合单因素试验结果，采用正交试验对发酵培养基中葡萄糖、玉米浆、接种量和蛋壳粉四种组分进行优化，试验设计如下：

表1 L9(34)正交因素水平表

1.2.5响应面法优化发酵工艺条件

培养基组分优化后，根据单因素试验结果，采用响应面法对发酵温度、发酵时间、摇床速率三个因素进行优化，试验设计见表2。

表2 响应面试验设计因素水平

2 结果与分析

2.1发酵单因素试验结果与分析

发酵单因素试验以L-乳酸钙的含量为指标，结果见图1。

2.2正交试验优化发酵培养基组分结果与分析

单因素试验结果为葡萄糖添加量6%、玉米浆添加量5%、接种量5%、蛋壳粉添加量5%,采用正交的方法按照表1设计对四种组分进行优化，摇床速率、发酵温度和发酵时间为单因素试验结果，分别为120 r/min、37℃和40 h，优化结果见表3。

表3 L9(34)正交试验设计及结果

由表3可知，影响乳酸钙含量的因素的主次顺序为：Agt;Cgt;Dgt;B。通过极差分析得到的最佳工艺条件为：A2B2C3D3，即：葡萄糖添加量6%、玉米浆添加量5%、接种量7%、蛋壳粉添加量7%，通过验证试验得出该培养基组分发酵时L-乳酸钙的含量为88.35 g/L。

2.3响应面法优化发酵工艺条件结果与分析

2.3.1响应面试验结果及二次模型方差分析

根据发酵温度、发酵时间和摇床速率单因素试验结果，采用响应面法对这三个发酵工艺条件进行优化，结果见表4和表5。

表4 响应面试验设计及结果

表5 响应面二次模型方差分析

注：Plt;0.05，影响显著；Plt;0.01,影响极显著。

2.3.2响应面交互作用结果与分析

由图2～图4可知，L-乳酸钙的含量随着各因素水平的增大呈现先增大后减少的趋势，但减少量较少。由图2～图4及表5可知，发酵时间和摇床速率两项交互作用显著。摇床速率对L-乳酸钙含量影响的等高线较密集，发酵时间和发酵温度对L-乳酸钙含量影响的等高线较稀疏，说明摇床速率的影响更为显著，与模型方差分析得出的结论一致。

图2 发酵温度和发酵时间对L-乳酸钙含量影响的响应面图

图3 发酵温度和摇床速率对L-乳酸钙含量影响的响应面图

图4 发酵时间和摇床速率对L-乳酸钙含量影响的响应面图

2.3.3最佳工艺条件确定及模型验证

通过模型分析确定最优发酵工艺条件：发酵温度37.25℃、发酵时间40.44 h、摇床速率152.17 r/min，L-乳酸钙的理论含量为89.55 g/L。从实际生产和经济效应方面考虑，将工艺条件修改为发酵温度37℃、发酵时间40 h、摇床速率150 r/min，重复试验后得出L-乳酸钙的实际含量为89.68 g/L，与理论值相差0.13 g/L。

3 讨论

蛋壳中的钙含量丰富，是天然绿色钙源，加大蛋壳中钙的利用，是一种有效提高蛋壳资源利用率、创造社会经济效益、减少环境污染的有效措施。发酵饲料所用的传统菌种为干酪乳杆菌、植物乳杆菌等。韦刚等[12]利用植物乳杆菌LP199发酵马蹄渣、马蹄淀粉废水制备饲料添加剂，产酸量达(0.91～1.10) g/(100 g)。Missotten等[13]利用植物乳杆菌发酵家禽饲料48 h,得到湿饲料饲喂肉鸡，提高了饲料利用率，使鸡空肠中段和回肠的绒毛高度分别提高了22.6%和16%。县怡涵等[14]使用植物乳杆菌和干酪乳杆菌菌液与去离子水对照灌胃7日龄仔猪，结果表明乳杆菌菌液可提高仔猪的进食量、降低料重比、提高仔猪的抗腹泻功能。尹淑帅[15]研究发现，将干酪乳杆菌ATCC393加入到雏鸡的饮用水中，可提高雏鸡肠道内乳酸菌的含量，并提高雏鸡的免疫机能，可以产生抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等有害菌生长的物质。Zhang等[16]研究发现，鼠李糖乳杆菌能够有效的减缓断奶仔猪的腹泻，使肠道中IGA分泌物增加，TNF-Α的分泌减少。本研究的鼠李糖乳杆菌，具有产L-乳酸量大，肠道黏着率高，且降低胆固醇含量，促进细胞分裂，调节肠道菌群、排除毒素、提高机体免疫力等重要的生理功能。以往生产乳酸钙往往采用MRS为发酵底物，成本较高。本研究采用生产玉米淀粉的副产物玉米浆为碳源，蛋壳粉为钙源发酵生产L-乳酸钙饲料添加剂，不仅提高了资源的利用率，同时降低了生产成本，为蛋壳资源在饲料中的应用做出了相应的贡献。

4 结论

以L-乳酸钙含量为指标，利用单因素和正交试验，对发酵制备高钙饲料添加剂的的培养基组分进行优化，采用响应面法优化发酵工艺条件，确定最佳培养基组分和发酵条件为葡萄糖添加量6%、玉米浆添加量5%、接种量7%、蛋壳粉添加量7%、发酵温度37℃、发酵时间40 h、摇床速率150 r/min，发酵液中L-乳酸钙含量89.68 g/L。

[1] VIRIYA-EMPIKULA N, KRASAEB P , PUTTASAWATB B,et al. Waste shells of mollusk and egg as biodiesel production catalysts[J]. Bioresource Technology, 2010, 101(10): 3 765-3 767.

[2] KEVIN J R, JOHN R E, AMY E, et al. Safety evaluation of a natural eggshell membrane-derived product[J]. Food and Chemical to Toxicology 2012, 50(3-4): 604-661.

[3] 韩 玉, 汪 兰, 孙智达,等.蛋壳及蛋壳膜吸附性质的研究进展[J]. 食品工业科技, 2012(13): 388-391.

[4] 司伟达, 王旭清, 韩兆鹏, 等．鸡蛋壳资源的再开发及研究进展[J]. 农产品加工, 2014(1): 36-37．

[5] CHANG S O. A study on the calcium bioavailability of eggshell powder in the growing rats[J]. The Korean Nutrition Society, 2003, 36(7): 684-690.

[6] ERIC R M, ROGELIO C, ROGELIO R, et al. Selectivity in the hydroxyapatite synthesis from eggshell using different thermal treatments[J]. Materials Research Innovation, 2003(7)：85-90．

[7] CORDEIRO C M ,HINCKE M T. Recent patents on eggshell: shell and membrane applications[J]. Recent Patents on Food Nutrition amp; Agriculture,2011, 3(1): 1-8.

[8] SONG Y L. Optimized extraction of calcium malate from eggshell treated by PEF and an absorption assessment in vitro[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2012, 50(5): 1 327-1 333.

[9] 王继华, 刘 伯. 甲酸钙, 乳酸钙, 柠檬酸钙及柠檬酸对断奶仔猪生长性能的影响[J]. 饲料研究, 2015 (8) : 23-27.

[10] 李逢振. 蛋壳中碳酸钙转化制取有机酸钙的研究[J]. 湖北农业科学, 2016, 55(15): 3 955-3 957.

[11] 闵 捷, 于尹尉, 肖 猛, 等. 米根霉发酵生产 L-乳酸钙条件的优化[J]．湖北农业科学, 2013, 5(52): 1 141-1 145．

[12] 韦 刚, 刘军义, 等. 农副产品废弃物资源化利用生产乳酸菌饲料添加剂的研究[J]. 食品与发酵科技, 2016, 52(5): 35-40.

[13] MISSOTTEN J A, MICHIEL S J, DIERICK N, et al. Effect of fermented moist feed on performance, gut bacteria and gut histomorphology in broilers[J]. British Poultry Science, 2013, 54(5): 627-634.

[14] 县怡涵, 赵秀英, 李晨博,等. 植物乳杆菌和干酪乳杆菌对仔猪生长性能、器官指数及小肠形态的影响[J]. 动物营养学报, 2015, 27(12): 3 805-3 811.

[15] 尹淑帅. 干酪乳杆菌部分生物学特性及其对肉雏鸡生长性能及主要免疫机能的影响[D]. 长春：吉林农业大学，2016.

[16] ZHANG L, XU Y Q, LIU H Y,et al. Evaluation of Lactobacillus rhamnosus GG using allEscherichiacoliK88 model of piglet diarrhea： Effects on diarrhoea incidence, faecal microflora and immune responses[J]. Veterinary Microbiology, 2010,141: 142-148.

(责任编辑：舒莲梅)

PreparationofliquidfeedadditivefromeggshellpowderfermentedbyLactobacillus

SU Liang，WEN Jia-qi，YOU Ying，HU Shu-meng，LIU Meng-yang，MA Jing，WANG Yu-hua

(College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China)

China, a great output of egg products country, the consumer demand of egg products is increasing progressively with years, while a large quantity of eggshells are discarded and the low utilization rate has caused the resources wasted and environment polluted. Feed additives were prepared by fermentation ofLactobacillusrhamnosususing eggshell as raw material. The components of four kinds of medium, glucose, corn steep liquor, inoculation amount and eggshell powder were optimized by orthogonal test, and the optimum dosage was obtained. The fermentation temperature, fermentation time and shaker rate were optimized by Box-Behnken test design, and the optimum fermentation process was obtained by response surface methodology. The results showed that the addition of glucose was 6%, the dosage of corn steep was 5%, the inoculation amount was 7%, the dosage of eggshell powder was 7%, the fermentation temperature was 37℃, the fermentation time was 40 h, the shaking rate was 150 r / min, the content ofL-calcium lactate was 89.68 g/L.

Lactobacillus; eggshell powder; L-calcium lactate; feed additive

2017-09-01；

2017-10-21

苏 亮(1993-)，男，硕士，研究方向为农产品加工与功能性食品。

王玉华(1972-)，女，教授，博士生导师，研究方向为食品生物制造及功能性食品。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.11.014

S816.6;S816.71

A

1003-6202(2017)11-0059-05