索拉菲尼通过活化p38MAPK抑制人口腔癌TCA8113细胞增殖

葛树卿 贾桂枝 戴红良 王玥 梁春光

索拉菲尼通过活化p38MAPK抑制人口腔癌TCA8113细胞增殖

葛树卿 贾桂枝 戴红良 王玥 梁春光

目的观察索拉菲尼对人口腔癌TCA8113细胞增殖的影响并探讨其作用机制。方法以浓度(2.5、5、10、20 μg/ml)索拉菲尼干预人口腔癌TCA8113细胞48 h后，以MTT法及集落形成实验检测细胞增殖，蛋白质免疫印迹检测不同浓度拉菲尼对p38MAPK活化的影响；为检测p38MAPK在索拉菲尼抗TCA8113细胞增殖中的作用，先以10 μmol/L SB203580(p38MAPK特异性抑制剂)预处理TCA8113细胞30 min，随后加入不同浓度索拉菲尼继续培养48 h，以MTT法检测细胞增殖情况。结果索拉菲尼能显著抑制TCA8113细胞的增殖，其抗增殖活性具有浓度依赖性；索拉菲尼还可明显增强p38MAPK的活化，而SB203580可显著缓解索拉菲尼诱导的TCA8113细胞活力下降。结论索拉菲尼可抑制人口腔癌TCA8113细胞的增殖，其机制可能与其增强p38MAPK活化有关。

索拉菲尼； TCA8113； 增殖； p38MAPK

作为最常见的口腔恶性肿瘤，口腔鳞状细胞癌占头颈部肿瘤的80%以上[1],其发病率在过去的十年间增加了50%。患者预后较差，即使通过手术切除，口腔癌仍存在着较高的局部复发率，患者死亡率并无明显下降，5 年生存率只有约50%[2-4]。因此，有必要开发有效的治疗药物以改善口腔癌患者的预后[5]。

索拉菲尼是一种供口服应用的多靶点的生物靶向新药，其作用靶点为肿瘤细胞及肿瘤周围血管组织上的受体酪氨酸激酶及其下游的丝/苏氨酸蛋白激酶[6]。研究显示索拉菲尼对C-Raf激酶、B-Raf激酶、血管内皮生长因子受体-2以及血小板源性生长因子β等均具有强大的抑制作用[7]。通过对上述蛋白激酶的抑制作用，索拉菲尼可显著抑制肿瘤细胞的增殖及血管化，发挥其抗肿瘤活性。研究显示，索拉菲尼可显著抑制肝癌[8]、胃癌[9]、滑膜肉瘤[10]、乳腺癌[11]等多种人类肿瘤的生长。而目前对索拉菲尼是否可抑制口腔癌的生长尚不清楚。为此，本研究拟探讨索拉菲尼对人口腔癌TCA8113细胞增殖的抑制作用及其作用机制，以期为临床上口腔癌应用分子靶向药物治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人口腔癌TCA8113细胞购自中国科学院上海细胞库；索拉菲尼购自拜耳公司；胎牛血清购自Hyclone公司；胰蛋白酶及p38MAPK特异性抑制剂SB203580、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)购于美国Sigma公司；RPMI-1640培养基购自美国康宁公司；RIPA裂解液购自南京诺维赞生物科技有限公司；p38MAPK、phospho-p38MAPK一抗购自SAB (Signalway antibody)公司, HRP标记二抗购自美国Santa Cruz公司。

1.2 TCA8113细胞培养

人口腔癌TCA8113细胞株以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，置于37 ℃、5% CO2培养箱中，0.25% EDTA胰酶消化细胞，每3天传代1 次。取对数生长期细胞用于实验。

1.3 细胞活力检测

采用MTT比色法检测索拉菲尼对TCA8113细胞活力的影响。取对数生长期的细胞接种于96 孔板。待细胞贴壁后，以0.1% DMSO(对照组)及不同浓度的索拉菲尼(2.5、5、10、20 μg/ml)作用TCA8113细胞48 h。随后加入MTT(终浓度: 5 mg/ml), 置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育4 h。弃去MTT, 加入150 μl DMSO在37 ℃作用10 min并充分振摇直到结晶充分溶解。用酶标仪(Bio-Rad)在波长490 nm处检测吸光度值。

1.4 集落形成实验

TCA8113细胞以1 000 个细胞/孔的密度接种于6孔培养板，待细胞贴壁后，以0.1% DMSO(对照组)及不同浓度的索拉菲尼作用TCA8113细胞10 d。以PBS清洗后，以4%多聚甲醛于室温固定20 min，再用PBS洗3 遍，用结晶紫染色，按下式计算集落形成率(colony-forming efficiency, CFE)：

CFE=(集落数/接种细胞数)×100%

1.5 Western blot

细胞以预冷PBS洗3 遍，加入RIPA细胞裂解液 [临用前加入0.1%苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride, PMSF)]提取细胞总蛋白， BCA法测定蛋白浓度。取35 μg总蛋白，行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。待电泳完成后电转移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。用1%BSA封闭1 h，接着加待检测蛋白的一抗4 ℃孵育过夜。TBS-T充分洗膜后，以HRP标记的二抗室温孵育2 h。TBS-T洗膜后，化学发光法(enhanced chemiluminescence，ECL)显色。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 索拉菲尼对TCA8113细胞活力的影响

与对照组相比，不同浓度索拉菲尼处理TCA8113细胞48 h后， MTT检测结果显示，随着索拉菲尼浓度的增加，TCA8113细胞活力逐渐降低(图 1)。

图 1 索拉菲尼对TCA8113细胞增殖的影响

Fig 1 The effects of sorafenib on the proliferation of TCA8113 cells

2.2 索拉菲尼对TCA8113细胞集落形成率的影响

与对照组相比，不同浓度索拉菲尼处理TCA8113细胞10 d后， 集落形成实验结果示随着索拉菲尼浓度的增加，TCA8113细胞集落形成率逐渐降低，当药物浓度达到10 μg/ml以上时，几乎没有集落形成(图 2)。

2.3 索拉菲尼对TCA8113细胞p38MAPK活化的影响

与对照组相比，不同浓度索拉菲尼处理TCA8113细胞48 h后，Western blot结果显示，TCA8113细胞p38MAPK的表达未发生明显变化，而不同浓度的索拉菲尼可明显增强磷酸化p38MAPK(phospho-p38MAPK)的表达，提示索拉菲尼的抗口腔癌细胞增殖活性可能与其促进p38MAPK的活化有关(图 3)。

2.4 SB203580对不同浓度索拉菲尼诱导的TCA8113细胞活力降低的影响

与对照组相比，不同浓度索拉菲尼处理TCA8113细胞48 h后，MTT检测结果显示，随着索拉菲尼浓度的增加，TCA8113细胞活力逐渐降低；而SB203580预处理能明显缓解由索拉菲尼诱导的癌细胞活力降低(图 4)，进一步表明索拉菲尼的抗口腔癌细胞增殖活性与其促进p38MAPK的活化有关。

图 2 索拉菲尼处理TCA8113细胞10 d后对集落形成率的影响

图 3 索拉菲尼对TCA8113细胞p38MAPK活化的影响

图 4 SB203580对不同浓度索拉菲尼诱导的TCA8113细胞活力降低的影响

Fig 4 The effects of SB203580 on sorafenib induced TCA8113 cell viability decrease

3 讨 论

口腔癌是世界上六种最常见的恶性肿瘤之一[12]。近年来其发病率逐年增高，并具有年轻化发展的趋势[13-14]。尽管口腔癌的诊疗手段不断进步，但目前对于其治疗仍极为困难，患者预后较差。舌癌的恶性程度高，往往在早期即出现较大范围的浸润和转移[14]。而外科治疗带来的部分或全舌缺如严重地影响患者的生存质量。因此，有必要开发新的抗口腔癌治疗药物及方式。

索拉菲尼的作用靶点为信号转导上游的受体酪氨酸激酶及其下游的丝/苏氨酸蛋白激酶。索拉菲尼既可通过抑制Raf/MEK/ERK通路直接抑制肿瘤的生长，又可通过抑制VEGFR、PDGFR及抑制肿瘤新生血管的形成而间接抑制肿瘤的增殖和转移[15]。研究证实，索拉菲尼对多种人类肿瘤都显示出有效的抑制活性[16]。目前对于索拉菲尼是否可抑制口腔癌细胞的增殖尚不清楚。本研究利用MTT及集落形成实验证实索拉菲尼对口腔癌细胞同样显示出强大的抗增殖活性，为我们进一步认识索拉菲尼的药理活性提供了实验依据。

p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶通路中的关键分子，大量研究证实p38MAPK的活化水平对于包括肺癌、结肠癌和宫颈癌等在内的多种肿瘤细胞的增殖、分化、转移、凋亡和肿瘤血管生成等均有重要的调控作用，促进p38MAPK的活化对多种肿瘤细胞有抑制作用[17-19]。如牛蒡苷抗口腔癌TCA8113细胞的增殖活性即与其促进p38MAPK的活化有关[14]。本研究结果发现，索拉菲尼明显促进p38MAPK的活化，而p38MAPK特异性抑制剂SB203580可显著缓解索拉非尼引起的癌细胞活力降低，充分说明索拉菲尼抑制TCA8113细胞的增殖的生物活性是通过诱导p38MAPK活化实现的。

本研究首次证实索拉菲尼对口腔癌细胞具有显著的抗增殖活性，该生物活性与其活化p38MAPK有关。该实验表明索拉菲尼有望成为新的抗口腔癌治疗药物。

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(收稿： 2016-10-26 修回： 2016-12-18)

SorafenibinhibitstheproliferationofhumanoralcancerTCA8113cellsthroughtheactivationofp38MAPK

GEShuqing1,JIAGuizhi2,DAIHongliang3,WangYue3,LiangChunguang3.

1. 121001Jinzhou,DepartmentofStomatologyoftheFirstAffiliatedHospital,JinzhouMedicalUniversity,China; 2.DepartmentofPhysiology,JinzhouMedicalUniversity; 3.SchoolofNursing,JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou

Objective: To investigate the effect of sorafenib on the proliferation of human oral cancer TCA8113 cells and to explore the underlying mechanisms.MethodsAfter treated with sorafenib at 2.5, 5, 10, 20 μg/ml respectively for 48 h, TCA8113 cell proliferation was examined by MTT and colony formation assay. Western blotting was employed to examine the p38MAPK expression in the cells. TCA8113 cells were pretreated with 10 μmol/L of SB203580 (a specific inhibitor of p38MAPK) for 30 min, and then by different concentrations of sorafenib for 48 h, cell proliferation was tested by MTT assay.ResultsSorafenib significantly inhibited the proliferation of TCA8113 cells in a concentration dependent fashion. Sorafenib also remarkably promoted the activation of p38MAPK of the cells. SB203580 significantly alleviated sorafenib induced TCA8113 cell viability decrease.ConclusionSorafenib can inhibit the proliferation of TCA8113 cells, which may be related to the activation of p38MAPK.

Sorafenib；TCA8113；Proliferation；p38MAPK

121001， 锦州医科大学附属第一医院口腔科[葛树卿(现在潍坊市人民医院口腔颌面外科)]； 锦州医科大学生理教研室(贾桂枝)； 锦州医科大学护理学院(戴红良 王玥 梁春光)

戴红良 E-mail：jy2006hldai@sohu.com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.01.023