高羊茅杂交后代ISSR遗传变异研究

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(1.浙江同济科技职业学院， 杭州 311231； 2.贵州省草业研究所， 贵阳 550006；3.贵州大学动物科学学院草业科学系， 贵阳 550025)

高羊茅杂交后代ISSR遗传变异研究

屈兴红1，吴佳海2，赵丽丽3，马林3，杨春燕2，曾洪学1

(1.浙江同济科技职业学院， 杭州 311231； 2.贵州省草业研究所， 贵阳 550006；3.贵州大学动物科学学院草业科学系， 贵阳 550025)

利用ISSR分子标记对高羊茅(Festucaarundinacea)杂交后代进行遗传多样性及亲缘关系分析。19个ISSR引物共扩增出255条重复性好、清晰的条带，其中200条是多态条带，多态条带比率(PPL)为78.4%，平均每个引物扩增多态条带数为10.5条，扩增片段大小范围为100～2 000 bp。结果表明，高羊茅杂交后代的多态性较高，遗传多样性较丰富。高羊茅杂交后代遗传相似性系数为0.647 1～0.851 0，聚类分析将高羊茅杂交后代划分为4个大类，有相同亲本的杂交后代先聚类。总之，ISSR标记可以有效地对高羊茅杂交后代进行“亲缘跟踪”和定向选择，为杂交育种提供分子依据。

高羊茅； 杂交后代； ISSR； 聚类分析

高羊茅(Festucaarundinacea)为禾本科(Poaceae)羊茅属(Festuca)多年生冷季型草坪草和牧草，具有耐干旱、耐盐碱、耐寒、耐涝、性喜光又耐荫等特点[1-3]，在绿化和畜牧业生产中具有重要作用[4-5]。

图1 ISSR引物 UBC 834 的扩增结果

特别是在贵州，高羊茅已成为全省草业生产中利用较多的草种之一。贵州省立地条件特殊复杂，高温高湿气候特征明显，培育适应当地气候条件的优良品种是高羊茅快速推广利用的前提。因此，贵州相关部门开展了大量高羊茅新品种选育工作，并取得了一些成绩，现已育成高羊茅品种2个，并利用杂交育种技术获得优良杂交后代多个[4]。

ISSR(inter-simple sequence repeat)是由Zietkiewicz等创建的一种新型DNA分子标记，能在分子水平上提供大量的遗传信息[6]。具有无需知道DNA序列信息、显性标记、重复性好、多态性丰富等优点[7]，广泛应用于植物遗传育种和遗传多样性研究[8-9]。本试验拟利用 ISSR分子标记技术分析高羊茅杂交后代间遗传关系，以探明杂交后代遗传变异特点，为高羊茅种质创新、遗传多样性研究和杂交后代选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试21个高羊茅种质中包括19个杂交后代[4]，2个育成品种(水城高羊茅和黔草1号高羊茅)，编号及杂交组合详见表1。

表1 供试高羊茅种质材料

编号杂交编号杂交编号杂交1A9×1168A6×11315A10×1722A8×1169A9×18516A220081893黔草1号10A10×16817A3×1114A9×11211A4×7618A120081905A6×11612A4×7619A320081116水城高羊茅13A4×7320A9×1857A9×18914A4×3421A11×183

1.2 基因组DNA提取与检测

每个种质采集幼嫩叶片，用植物基因组试剂盒(购自北京天根生化科技有限公司)提取DNA，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，将DNA稀释至10 ng/μL，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3 ISSR-PCR扩增体系

参照加拿大哥伦比亚大学UBC公司公布的第9套ISSR引物序列，从中选择60条交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。从60个ISSR引物中筛选出19个扩增条带多、稳定性好、背景清晰的引物(见表2)用于正式扩增。

经摸索后确定PCR最佳扩增体系为20μL：10×Mix 10μL，引物(0.8μM) 1μL，DNA(10 ng) 2μL，ddH2O 7μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53.9～61.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4 ISSR扩增产物的检测

PCR反应结束后，取5μL PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶电泳中检测，100 V恒压电泳30 min。电泳缓冲液为1×TAE。电泳结束后利用凝胶成像系统观测、拍照。

1.5 数据统计与分析

选取清晰、重复性好、分辨率高的条带用于分析，按照相同迁移位置上有扩增条带记为1、无记为0的方法记录每个引物的电泳条带，构成ISSR表型数据矩阵。用NTSYS-PC软件[10]进行Nei-Li遗传相似系数(GS)分析和UPGMA。

2 结果与分析

2.1 ISSR扩增结果及多态性分析

观察各引物扩增条带的清晰度和多态性程度，从60条ISSR引物中筛选出19条扩增条带清晰、多态性高的引物，图1为引物UBC 834的扩增情况。19条ISSR引物共扩增出255条清晰可重复的条带，其中200条是多态条带，多态条带比率(PPL)为78.4%。每条引物可扩增的多态条带数目为2～16条，平均扩增多态条带数为10.5条，扩增片段大小范围为100～2 000 bp(见表2)。

2.2 聚类分析

高羊茅杂交后代的遗传相似系数GS值的范围在0.647 1～0.851 0之间。根据遗传相似性系数矩阵，利用UPMGMA法进行聚类分析。在遗传相似性系数为0.724时，供试高羊茅被分为4大类(见图2)，第1类仅有3号，为黔草1号高羊茅品种；第2类由18(A 12008190)和19(A 32008111)号组成；第3类由15(A 10×172)、16(A 22008189)、17(A 3×111)和10(A 10×168)号组成；第4类由1(A 9×116)、2(A 8×116)、5(A 6×116)、8(A 6×113)、7(A 9×189)、9(A 9×185)、20(A 9×185)、11(A 4×76)、12(A 4×76)、13(A 4×73)、14(A 4×34)、4(A 9×112)、6(水城高羊茅)和21(A 11×183)组成。在第4类中，杂交后代9与20最先聚到一起，其次为前二者与7、11与12，再次为5与8、13与14，表明这几份杂交后代间的亲缘关系最近。

图2 高羊茅杂交后代ISSR标记的UPGMA聚类图

表2 19条ISSR引物扩增结果

引物序列扩增条带多态条带条带大小(bp)多态条带比率(%)UBC834(Ag)8YT106100～100060．0UBC810(gA)8T2116100～200076．2UBC855(AC)8YT118250～200072．7UBC808(Ag)8C97100～75077．8UBC812(gA)8A1612100～200075．0UBC817(CA)8A1616100～2000100．0UBC826(AC)8C1312250～200092．3UBC835(Ag)8YC72100～75028．6UBC868(gAA)688250～2000100．0UBC850(gT)8YC1311100～100084．6UBC836(Ag)8YA1311100～100084．6UBC873(gACA)41613100～200081．3UBC807(Ag)8T158100～200053．3UBC856(AC)8YA1310100～200076．9UBC820(gT)8C158100～200053．3UBC825(AC)8T1210100～100083．3UBC818(CA)8g1515100～2000100．0UBC841(gA)8YC1915100～200078．9UBC842(gA)8Yg1312100～75092．3总数255200100～200078．4平均13．410．5

3 讨 论

高羊茅为异花授粉植物，其品种多为异质杂合群体，群体内存在的大量变异严重阻碍了基于表型性状的传统杂交后代鉴定与遗传分析方法的应用[11-12]。分子标记的运用从植物DNA基因组上可以很好地解决这一难题[13]。ISSR分子标记技术采用的引物长度为16～25 bp，PCR扩增退火温度高，且含有重复序列，使其具有较高的多态性水平及重现性，而且不需要预先克隆与测序，已成功应用于杂交后代鉴定分析、植物遗传多样性分析等众多研究领域[14-15]。利用 ISSR 技术对植物杂交后代进行遗传变异分析的关键在于筛选出扩增性强、稳定性好的引物[16]。本研究对高羊茅杂交后代基因组DNA进行ISSR分析，从60条ISSR引物中筛选出19条稳定多态性引物，扩增出255条清晰可重复的条带，其中具有多态性的有200条，多态条带比率达78.4%，表明高羊茅杂交后代的多态性较高，遗传多样性较丰富。

通过ISSR分子标记检测出供试高羊茅杂交后代的遗传相似系数GS值的范围为0.647 1～0.851 0之间，结合聚类分析表明，有相同亲本的杂交后代先聚到一起，表明其亲缘关系相对较近，如9(A 9×185)与20(A 9×185)及7(A 9×189)、5(A 6×116)与8(A 6×113)、11(A 4×76)与12(A 4×76)、13(A 4×73)与14(A 4×34)、1(A 9×116)与2(A 8×116)等；而育成品种“黔草1号”高羊茅单独成为一类，表明其与其余20个材料间亲缘关系最远。

总之，利用ISSR分子标记技术研究高羊茅杂交后代植物遗传多样性是可行的。在高羊茅杂交育种过程中，可以通过分子标记技术对杂交后代进行“亲缘跟踪”和定向选择，为杂交育种提供理论依据。

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Genetic Variation Among Hybrids of Tall Fescue Based onISSR Molecular Markers

QUXinghong1,WUJiahai2,ZHAOLili3,MALin3,YANGChunyan2,ZENGHongxue1

(1.Zhejiang Tongji Vocational College of Science and Technology,Hangzhou 311231,China；2.Guizhou Prataculture Institute,Guiyang 550006,China；3.Department of Grassland Science,College of Animal Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

The genetic diversity and genus relationship of tall Fescue hybrids was investigated by the ISSR molecular markers technique.There were 255 DNA bands were amplified using 19 reliable ISSR primers, among which 200 DNA bands were polymorphic.The percentage of polymorphic bands reached 78.4%. Every primer had 10.5 polymorphic bands in average.The length of amplified DNA fragments ranged from 100 bp to 2 000 bp.The result showed that the polymorphism of ISSR marker in tall fescue hybrids was high.The genetic similarity among tall fescue hybrids were 0.647 1-0.851 0.The results of cluster analysis using the unweighted pairground method with arithmetic average (UPGMA) based on ISSR data showed that these tested resources were divided into four main groups,the hybrids with the same parent clustered,firstly.So,ISSR markers can be used as an effective molecular technique for directional selection of the interspecific hybrid and the study of tall fescue cross-breeding.

tall fescue; hybrid; ISSR; cluster analysis

2016-08-29

省优秀青年科技人才专项(黔科合人字[2011]18号)；贵州省农业攻关计划项目(黔科合NY字[2008]3070号)；贵州省农业攻关计划项目(黔科合NY字[2014]3048号、黔科合NY字[2010]3049号)。

屈兴红(1979—)，女，河南省淅川县人；硕士，实验师，主要从事设施农业技术；E-mail：xhqu2004@163.com。

吴佳海(1969—)，男，研究员；E-mail：wujiahai2003@yahoo.com.cn。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.01.019

S 543

A

1001-4705(2017)01-0019-04