山葵愈伤组织诱导的最佳条件筛选

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(1.成都大学生物产业学院， 四川 成都 610016； 2.广元市玺府开发有限公司， 四川 广元 648017)

·种子生产·

山葵愈伤组织诱导的最佳条件筛选

王跃华1，何新友1，刘洪明1，任三军2，刘鑫1

(1.成都大学生物产业学院， 四川 成都 610016； 2.广元市玺府开发有限公司， 四川 广元 648017)

[目的]获得诱导山葵愈伤组织的最佳条件。[方法]通过L16(44)正交试验法考察了外植体种类、消毒时间、培养基配方和培养温度等四方面因素对山葵愈伤组织诱导率的影响。[结果]试验结果显示，各因素与山葵愈伤组织的诱导率密切相关，影响大小为：外植体种类>培养温度>培养基配方>消毒时间。[结论]诱导山葵愈伤组织的最佳组合为，选择胚轴为外植体，经5 min消毒后接种于MS+2,4-D 1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培养基中，在20 ℃条件下培养25 d，山葵愈伤组织的诱导率可达100%。

正交试验； 山葵； 愈伤组织

山葵(WasabijaponicaMatsum)为十字花科山嵛菜属多年生草本植物，又名山嵛菜，是一种珍稀名贵的香辛蔬菜[1]；目前山葵主产日本、东南亚国家及港澳台地区，除地区消费外，其产品主要用于出口创汇，市场价值显著，极具发展前景[2]。山葵植物中所含有的异硫氰酸酯类物质，具有很好的抗菌、抗癌、抗感染、防腐、抑制血小板凝聚和增进食欲等功效[3-5]，具有广泛的应用前景。然而，目前山葵植物资源极其匮乏，一直处于供不应求的状况。这主要是因为山葵植物的生长对环境要求极为苛刻，仅适于在海拔高度为1 000～2 000 m的高山地区种植，生育温度超过30 ℃易发生软腐病，但低于-3 ℃时又易受冻害；另外，山葵植物生长过程中病虫害也严重,尤其是墨入病的严重危害,极大的影响山葵的产量和质量[6-8]。因此，完全靠自然条件下生产山葵植物产量较低，有必要通过组织培养的方式快速生产山葵，以满足市场的需求。本研究通过对不同组织培养条件进行筛选，获得山葵愈伤组织诱导的最优条件组合。

1 材料和方法

1.1 材 料

山葵种子来源于四川省广元市，试验材料为山葵种子萌发幼苗的真叶、子叶、子叶柄和胚轴。

1.2 方 法

本实验采用L16(44)正交试验设计法(见表1)。分别取萌发10 d左右山葵幼苗的子叶、真叶、子叶柄和胚轴为外植体，采用0.1%升汞溶液消毒3，5，7 min和9 min后，接入A 1 (MS+2,4-D 1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L)、A 2( MS+2,4-D 2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L)、A 3(MS+2,4-D 4 mg/L+6-BA 0.5 mg/L)和A 4(MS+2,4-D 8 mg/L+6-BA 0.5 mg/L)4种不同激素配比的培养基，分别放置在温度为10，15，20 ℃和30 ℃的条件下培养，各种处理的外植体数为40个，进行3次重复，在培养25 d后进行愈伤组织诱导率的数据统计。

表1 L16(44)水平和因素表

水平A消毒时间(min)B培养基配方C培养温度(℃)D外植体13A110子叶25A215真叶37A320胚轴49A430子叶柄

1.3 数据处理方法

2 结果与分析

2.1 正交试验结果分析

从表2可以看出，本试验的愈伤组织诱导率差异明显；其中编号5组合的愈伤组织诱导率最高，即选择胚轴为外植体，经5min消毒后接种于MS+2,4-D 1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培养基中，放于20 ℃条件下培养25 d，愈伤组织诱导率为(100±0.00)%。而编号7的组合愈伤组织诱导率最低，即以子叶柄为外植体，经5 min消毒后接种于接种于MS+2,4-D 4 mg/L+6-BA 0.5 mg/L培养基中，放于10 ℃条件下培养25 d，愈伤组织诱导率仅为(3.24±4.81)%。

表2 山葵正交试验结果

编号ABCD诱导率(%)111114.93±1.462122380.43±2.163133267.92±1.34414446.16±5.7352133100±0.00622416.68±2.84723143.24±4.818242231.28±6.539312410.56±5.241032125.87±1.4611334378.19±1.571234319.16±3.6813414215.43±4.501442347.61±2.6515432120.47±4.341644136.35±2.49

注：表中数据为25 d统计结果。

通过观察上述各外植体产生愈伤组织的情况还可发现，胚轴的愈伤组织最先从接入培养基的游离端开始产生，随后整个胚轴都可愈伤化产生出愈伤组织，并且愈伤组织生长速度快、数量多、颜色多为黄绿色和浅黄色，质地较紧密；子叶柄的愈伤组织最先也是从其接入培养基的游离端开始产生的，但子叶柄在产生愈伤组织的部位先要生产明显的膨大，随后表皮出现胀爆开，愈伤组织的产生主要是由子叶柄皮层以内细胞产生的，愈伤组织生长较慢、数量也少，颜色浅黄色、质地较疏松；真叶的愈伤组织产生最先是从其伤口处产生，随后在真叶的上下叶片表面也都有愈伤组织长出，愈伤组织的颜色为绿色和浅绿色，质地较紧密；子叶外植体的愈伤组织主要在其伤口处产生，愈伤组织的生长速度很慢，颜色多为黄色和黄褐色，后期很难再增殖生长。

2.2 极差分析

极差值在正交试验中表示各因素对试验结果的影响程度，且两者间呈正相关关系，即极差值越大，试验因素对试验结果影响越大[9]。为了进一步明确各因素对试验结果的影响，对表2所示结果进行极差分析(见表3)。结果显示，因素A、B、C、D的极差值分别为27.395、29.218、41.075、59.350，可见各因素对试验结果的影响大小依次为：外植体种类>培养温度>培养基配方>消毒时间。

表3 极差分析

因素ABCDK1159.440130.92020.39041.240K2141.200100.590142.740120.500K3103.780169.820184.690264.970K449.86052.950106.46027.570k139.86032.7305.09810.310k235.30025.14835.68530.125k325.94542.45546.17366.243k412.46513.23826.6156.893R27.39529.21841.07559.350

2.3 方差分析

由表4可以看出，各因素对试验结果的影响差异明显，其中因素D达到极显著水平，因素C达到显著水平，而因素A、B影响并不显著；由此可见，山葵愈伤组织诱导过程中，外植体种类与培养温度是其愈伤组织诱导的关键因素，尤其是外植体种类影响最为显著，这是由于植物不同器官的细胞在产生愈伤组织的过程中，必须要完成细胞的脱分化过程，而山葵植物不同器官的细胞其脱分化的能力各不相同，因此各外植体的愈伤组织诱导情况各不相同，实验结果也显示，山葵胚轴外植体器官细胞的脱分化能力最强。

表4 方差分析

因素SS自由度MSFF0.05F0.01显著性A1755.573585.197.449.2829.46—B1827.093609.037.749.2829.46—C3660.5031220.1715.509.2829.46*D8899.4032966.4737.699.2829.46**

注：“**”表示在0.01水平上差异极显著；“*”表示在0.05水平上差异显著。

3 讨 论

植物愈伤组织的诱导是组织培养过程中的重要环节，通过建立植物的愈伤组织培养体系，还可进行细胞悬浮培养，并为实现植物组织细胞的大规模工业化生产奠定基础。然而，不同植物器官组织要离体培育出愈伤组织，会受到诸多因素的综合影响；所以，如何筛选出最佳组合条件诱导山葵愈伤组织产生就显得尤为重要。王安虎等[10]、张建佳等[11]和王建美等[12]曾对山葵愈伤组织的诱导条件进行了一些单因素研究，而本实验利用正交试验的方法，突破了传统单一变量筛选法的诸多缺点，一次性综合分析研究了影响山葵愈伤组织诱导的4个因素即外植体种类、培养温度和培养基配方及外植体消毒时间，探明了不同因素的影响大小并在此基础上筛选出了诱导山葵愈伤组织培养的最佳组合，为进一步开展山葵细胞大规模的工业化发酵生产奠定了坚实的基础。

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[5]Yasujiro Morimitsu,Kzauhiro Hayashi,Yoko Nakagawa,et al.Antip latelet and anticancer isothiocyanates in Japanese domestic horseradish,Wasabi Mechanisms of Ageing and Development,2000,116:125-134.

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[12]王建美.山葵组织培养及愈伤组织成分分析[D].四川大学硕士论文,2001.

Screening the Best Conditions ofWasabiCallus Induction

WANGYuehua1，HEXinyou1，LIUHongming1，RENSanjun2，LIUXin1

2016-10-19

成都市科技支撑计划项目(2015-NY 02-00148-NC)。

王跃华(1963—)，女，教授，主要从事药用植物栽培与生药学研究；E-mail:1961689636@qq.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.04.124

S 567.23+9

A

1001-4705(2017)04-0124-03