奶牛乳中体细胞DNA染色方法的研究

文/冯万宇 周庆民 徐 馨 张 艳 宁秀云

（1黑龙江省兽医科学研究所；2讷河市动物防疫站）

奶牛乳中体细胞DNA染色方法的研究

文/冯万宇1周庆民1徐 馨1张 艳1宁秀云2

（1黑龙江省兽医科学研究所；2讷河市动物防疫站）

以甲基绿为染色剂，研究其对奶牛乳中体细胞DNA的染色效果，建立一种牛乳体细胞DNA染色方法，结果表明：随着牛乳中体细胞数的增加，DNA含量也随之增加，经甲基绿处理的DNA颜色逐渐加深，这为利用甲基绿进行DNA染色分析牛乳体细胞数和奶牛隐性乳房炎诊断提供了科学依据，为奶牛隐性乳房炎的诊断、判断预后及其监测提供了一种新方法和途径。

甲基绿；体细胞DNA；奶牛；隐性乳房炎

隐性乳房炎一直是影响奶牛业发展的瓶颈之一，发病奶牛无临床发病表现，其指征主要是发病奶牛泌乳量不同程度下降，乳中体细胞总数升高，乳中的主要成分乳脂、乳蛋白、乳糖含量均有不同程度地下降，乳质差，出现劣质乳和废弃乳，如果管理不当病情加重，极易转化为临床型乳房炎，治疗和管理费用会大幅度增加，乳中出现抗生素等药物残留，既产生了药残奶，也会因用药后的休药期使有效产奶量显著减少，若治疗无效则会造成奶牛淘汰，严重危害奶牛业的健康发展。

对隐性乳房炎控制最有效的手段是早发现早治疗，使隐性乳房炎奶牛尽早转归为正常健康奶牛，国内外监测隐性乳房炎是通用乳中体细胞计数，根据每毫升乳中体细胞总数的不同设置判断隐性乳房炎的最低阈值，直接显微镜计数无疑是计算体细胞数最准确的方法，但耗时长，操作复杂，需要特定的仪器和有经验的专业人员操作才能减少误差[1]。

加州奶牛乳房炎试验（CMT）是国际通用的诊断隐性乳房炎的方法，在此基础上衍生出WMT、PL、BMT、HMT等一系列类似的方法，这些方法都具有简单方便、快速、敏感的优点，但最大不足在于其所提供的仅仅是体细胞的一个相对数量，结果严重依赖于检测者的经验，易出现假阳性。Urbanova应用吲哚裂解牛乳体细胞，经分光光度计检测DNA含量证实，牛乳体细胞数量与其中的DNA含量成正比，DNA测定法比CMT、WMT等方法精确性更高，但由于以往DNA分离过程复杂，检测繁琐，难以在奶牛场和乳品检验中心大规模推广应用[2]。

甲基绿是一种常见的染料，在水溶液状态下与DNA结合后显示绿色，是DNA鉴定常用的一种方法。本研究在前期牛乳体细胞裂解的基础上，以甲基绿为染色液，研究甲基绿对经碘化钾裂解后不同浓度牛乳体细胞DNA染色效果，以期为应用甲基绿染色法诊断奶牛隐性乳房炎提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

乳样来自齐齐哈尔郊区某规模化标准奶牛场，日粮为TMR全混合日粮，以全程机械榨乳方式挤乳，每日3 次。

1.2 试验试剂

试验中所用到的主要试剂包括0.2 mol/L PBS，5 mol/L 碘化钾，2%甲基绿，二甲苯，美兰乙醇饱和溶液，95%乙醇等。

1.3 试验仪器

台式离心机；生物显微镜；生物分光光度计；载玻片；微量移液器和100 μL、200 μL枪头若干。

1.4 试验方法

1.4.1 奶样采集

试验奶牛乳房用温水清洗后，用一次性纸巾擦干，手工挤出前三把乳后弃去，随即开始采样，冰盒低温冷藏后迅速送至实验室检测。

1.4.2 奶样检测

将新鲜乳样充分摇匀，用微量移液器吸取中部乳汁10 μL，滴于载玻片一端中侧，仔细涂布成约1 cm2面积的乳膜，37 ℃温箱干燥，然后用二甲苯脱脂5 min，再置于95%乙醇中固定5～10 min。干燥后，用美蓝染色液染色5 min。水洗，再用95%乙醇脱色数分钟，水洗干燥后镜检。在生物显微镜油镜下观察，计100 个视野内的细胞数，对体细胞数高于10 万个/mL以上者留样进行如下试验。

1.4.3 乳样体细胞DNA染色

取乳样5 mL，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，弃去脂肪层和脱脂乳层，以乙醇脱脂棉球拭去离心管内壁上的乳脂，加入PBS至5 mL，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，吸取上清液弃去，加入PBS混匀至5 mL。用微量移液器取混匀的体细胞悬液100μL至2 mL试管中，随后加入5 mo1/L 碘化钾溶液100 μL混匀，2 min后加入2 %甲基绿溶液200 μL，混匀3 min后观察试管内颜色变化。

2 试验结果

2.1 碘化钾对牛乳体细胞的裂解效果

碘化钾对不同浓度牛乳体细胞DNA提取的数量和纯度的影响见表1，牛乳体细胞数与DNA含量之间的关系见图1。

由表1和图1可知，随着每毫升牛乳中体细胞数量的增多，碘化钾裂解出来的DNA数量也呈现逐渐增多趋势，牛乳中体细胞数量与DNA呈正相关，经分光光度计检验出来的D260nm与D280nm比值基本在1.8～1.9，说明5 moI/L碘化钾溶液对牛乳中体细胞裂解完全、纯度高，裂解出来的DNA没有出现蛋白质和RNA污染。

2.2 甲基绿对牛乳体细胞DNA染色效果

甲基绿对不同数量体细胞DNA染色结果见表2。

由表2可知，随着牛乳体细胞裂解释放DNA数量的增多，与甲基绿结合的DNA数量也不断增加，试管内DNA颜色由浅蓝绿色逐渐过渡为浅绿、淡绿色乃至深绿色到墨绿色，表明牛乳体细胞DNA裂解染色后的颜色变化与体细胞数呈现正相关。表2中的数据也表明，当牛乳中体细胞数在0～2.9×105个/mL时，其中DNA经甲基绿处理后呈现淡蓝绿色；牛乳体细胞数在3.0×105～4.9×105个/mL时，其中DNA经甲基绿处理后呈现浅绿色；牛乳体细胞数在5.0×105～7.9×105个/mL时，其中DNA经甲基绿处理后呈淡绿色；牛乳体细胞数在8.0×105～14.9×105个/mL时，其中DNA经甲基绿处理后呈绿色；牛乳体细胞数在15.0×105～49.9×105个/mL时，其中DNA经甲基绿处理后呈深绿色；牛乳体细胞数在50×105个/mL以上时，其中DNA经甲基绿处理后呈墨绿色，根据以上结果，可以将体细胞裂解技术与DNA染色技术相结合建立一种新的奶牛隐性乳房炎诊断方法，即根据牛乳体细胞数裂解释放的DNA染色后的颜色变化反映牛乳体细胞数，颜色越深，体细胞数越高。

表1 碘化钾对不同浓度牛乳体细胞DNA提取的数量和纯度的影响

表2 碘化钾对不同浓度牛乳体细胞DNA提取的数量和纯度的影响

3 讨论与小结

体细胞直接显微镜计数（DMSCC）一直是诊断奶牛隐性乳房炎最可靠的方法，以每毫升乳中体细胞数量为主要判断依据，该方法精度和准确度高，但试验操作复杂，消耗时间长，在直接显微镜计数法基础上衍生出CMT检测法是目前成为判断牛乳优劣的国际通用金标准[3]。该检测方法操作简捷，受外界环境干扰少，适合于临床推广应用，但其只是一个体细胞相对数量，受检验者的经验及个人操作差异影响，经常出现假阳性判断结果 [1，2]。

Urbanova研究证实，牛乳中体细胞破坏后释放出来的DNA含量与体细胞数呈正比[2]，与CMT法相比，采用DNA测定法精确度更高，但由于DNA分离繁琐，难以在奶牛场推广应用，寻求乳中体细胞裂解效率好、DNA提取充分，纯度高是实现利用DNA法精确测定牛乳体细胞数的前提条件。

本试验以碘化钾为牛乳体细胞裂解剂，将细胞中的DNA完全释放出来，并采用甲基绿对其进行染色，随着牛乳体细胞裂解释放DNA数量增多，与甲基绿结合的数量也不断增加，加入的甲基溶液也由浅蓝绿色逐渐过渡为浅绿、淡绿色乃至深绿色到墨绿色。当牛乳体细胞数在2.9×105个/mL以下时，裂解出来的DNA经甲基绿处理后呈现淡蓝绿色；牛乳体细胞数在3.0×105～4.9×105个/mL时，裂解出来的DNA经甲基绿处理后呈现浅绿色；牛乳体细胞数在5.0×105～7.9×105个/mL时，裂解出来的DNA经甲基绿处理后呈淡绿色；牛乳体细胞数在8.0×105～14.9×105个/mL时，裂解出来的DNA经甲基绿处理后呈绿色；牛乳体细胞数在15.0×105～49.9×105个/mL时，裂解出来的DNA经甲基绿处理后呈深绿色；牛乳体细胞数在50×105个/mL以上时，裂解出来的DNA经甲基绿处理后呈墨绿色，单位数量牛乳中体细胞数越高，经碘化钾裂解出来的DNA数量也就越多，染色后颜色也就越深，由此可依据牛乳体细胞数裂解释放出来的DNA染色后的颜色变化深浅反映牛乳体细胞数的多少，染色颜色越深，体细胞数越高。

从试验结果看，5 mol/L碘化钾溶液对牛乳体细胞裂解完全、纯度高、数量大，无蛋白质和RNA污染，经甲基绿染色后，不同浓度DNA反映出来的颜色也不相同，DNA数量越多，颜色越深。由此可以将体细胞裂解技术和DNA染色技术相结合，建立一种新的奶牛隐性乳房炎诊断方法。

从整个试验结果来看，本研究建立的奶牛隐性乳房炎诊断方法简单、准确、易操作，所需化学试剂也廉价易采购，结果容易判别，误差小，技术要求精度低，是一种新的适合于奶牛隐性乳房炎诊断的方法。

[1] 朱彤，王亚犁，宋文杰. 国内外牛奶中体细胞数研究进展[J]. 中兽医医药杂志，2016，35（6）：84-88.

[2] Urbanova E，Seinova V，Skarda J，et al.Use of the synpor membranc filter for the separation and determination of the number of somatic cells in the milk of dairy cows using the indole DNA filtration method[J].Veterinarini Medicina，1985，30（7）：409-418.

[3] 马金梅，迟良，邹明，等. 奶牛隐性乳房炎诊断技术研究进展[J]. 中国动物保健，2016，33（11）：71-74.

[4] 黄庆玉，申姜颖，龙跃洲，等. DNA酸解后甲基绿—派洛宁改良染色法在胃癌、食管癌诊断中的应用[J]. 泰山医学院学报，2000（4）：270-273.

冯万宇（1976-），男，黑龙江省木兰县人，硕士，副研究员，主要从事奶牛普通病防治研究工作。

2017-06-05）