微生物转化法提高甘草中甘草次酸的质量分数

王宇晴，孙雅北，矫佳陈琦，郑春英

(黑龙江大学 生命科学学院 微生物黑龙江省高校重点实验室，哈尔滨 150080)

微生物转化法提高甘草中甘草次酸的质量分数

王宇晴，孙雅北，矫佳陈琦，郑春英

(黑龙江大学 生命科学学院 微生物黑龙江省高校重点实验室，哈尔滨 150080)

开发一种微生物转化法提高甘草中甘草次酸质量分数的制备工艺，为工业化生产甘草次酸提供新方法.以甘草内生真菌RE4及甘草内生真菌RE11混合液体培养转化处理甘草后，甘草次酸质量分数显著提高，经工艺优化后甘草次酸的质量分数提高到3.892 9 mg/g，是未经转化处理时0.128 3 mg/g的30.34倍，采用超声提取，大孔树脂及硅胶柱分离转化后的甘草样品，经分离后甘草次酸单体的产率可达2.03 mg/g，约为生药中甘草次酸的30倍.微生物转化甘草可以提高甘草次酸产率，具有工艺简单，能消耗少，生产成本低等优点.

甘草；微生物转化；甘草次酸；提取

甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)，药用植物甘草的主要活性成分[1]，为五环三萜类化合物[2]，具有明显的抗菌[3]、抗炎[4]、抗肿瘤[5]、抗病毒[6-7]、抗紫外线损伤[8]、免疫调节[9]等多方面的药理活性，是食品、医药、化妆品行业的重要生产原料.当前，甘草次酸原料主要采用传统的酸化裂解法[10]从甘草生药中提取，但此方法存在着生产工艺复杂、产率低、费用高等缺点.

微生物转化是利用微生物代谢过程中产生的酶系对外源性化合物进行催化反应的过程，反应条件温和、可提高食品、药品中的某些活性成分含量[11]、可避免某些活性成分被分解破坏[12]、反应产物立体选择性好、较易获得结构新颖的化合物等特点；同时符合生物体代谢规律，发现具有生理活性的代谢产物几率高[13]，可为食品、药品活性成分原料的获得提供新方法.本文采用甘草内生真菌RE4及内生真菌RE11混合转化乌拉尔甘草以提高甘草次酸的得率；同时对发酵样品中的甘草次酸进行提取分离，为甘草次酸原料的生产提供新方法.

1 实验部分

1.1仪器与试剂

HZQ-C 空气浴振荡器(哈尔滨市东明医疗仪器厂)；HPS-160电热恒温培养箱(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)；高效液相色谱仪(FL2200，浙江温岭)；Venusil XBP C18色谱柱(Agela Technologies lnc).

实验用健康乌拉尔甘草样品分别于2014年7～9月采自黑龙江省大庆地区，经黑龙江大学生命科学学院郑春英教授鉴定为乌拉尔甘草(GlycrrhizauralensisFisch).

甘草内生真菌RE4(Aspergillus versicolor，CCTCC，No：M 2012045)及RE11(Penicillium chrysogenum，CCTCC，No：M 2012047)现保存于中国典型培养物保藏中心.

甘草次酸(中国药品生物制品检定所110723-200612)；甲醇、冰醋酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯.

PDA培养基：同文献[14].

1.2方法

1.2.1 内生真菌RE4及RE11菌悬液的制备

分别取已活化的甘草内生真菌RE4及RE11(PDA培养基)，加入一定量无菌水，各制成1×106CFU/mL的菌悬液，备用.

1.2.2 甘草的生物转化

精密称取不同时间采集的6批甘草生药样品的根茎粉(40目)6g(每批样品6份)，置于100 mL锥形瓶中，加入2倍量PDA(m/V)，密封，于121℃灭菌30 min，取出，作为底物备用；取“1.2.1”中的菌悬液各3 mL混匀后加入到底物中；另外，取底物加入 6 mL 无菌水作为空白对照样品，将所有样品放入转速为180 r/min的摇床，于28 ℃培养5 d取出，冻干，冻干条件为：-20 ℃预冻6 h，设置冷肼温度为-85 ℃，真空度0.5 MPa，加热板温度设置为10 ℃.样品冻干至恒重后，将冻干样品及时转移至干燥器中保存，备用.

1.2.3 甘草次酸的质量比变化

分别精密称取甘草根茎、“1.2.2”项下甘草冻干样品及空白对照样品各1 g，准确加入10 mL 甲醇，称重，超声 60 min，冷却，取出，放冷，以甲醇补足减失的重量后过滤，取续滤液 4 mL于10 mL 容量瓶，定容后即为供试品溶液；采用HPLC法，参见文献[15]分析计算甘草经微生物转化前后其甘草次酸的质量比变化.

1.2. 4 微生物转化样品中甘草次酸的提取分离

将RE4-RE11转化后的甘草冻干样品200 g，以70%乙醇浸泡90 min 后，超声提取60 min，抽滤，滤液旋转蒸发，得清膏，清膏用水溶解后通过D101型大孔树脂柱，并以乙醇梯度洗脱(乙醇体积分数30%，50%，70%，95%).收集30%的乙醇馏分2 L，回收溶剂后进行硅胶柱分离，并以石油醚∶乙酸乙酯(15∶5)洗脱后，再用石油醚∶乙酸乙酯(10∶10)洗脱，收集洗脱液，重结晶，得单体化合物；以甘草次酸为对照，利用薄层鉴别(硅胶GF254板，展开剂：石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸(15∶5∶1))及HPLC/MS法确定所得单体化合物为甘草次酸.

2 结果讨论

2.1转化菌株的筛选

选取8株甘草内生真菌：RP4，RP5，RE2，RE4，RE5，RE9，RE11，RE13为转化菌株，利用这些菌株发酵转化甘草，甘草次酸质量分数变化见表1.

组别菌株编号甘草次酸质量比/(mg·g-1)1RP40.3080±0.0048**△△2RP50.3233±0.0026**△△3RE20.5228±0.0013**△△4RE40.6210±0.0025**△△5RE50.3847±0.0007**△△6RE90.5181±0.0019**△△7RE110.5266±0.0051**△△8RE130.1793±0.0039**△△9甘草生药0.1283±0.001110空白样品0.1236±0.000811PDA对照———

注：同甘草生药组相比*P<0.05，**P<0.01；同空白对照组相比△P<0.05，△△P<0.01；PDA培养基中未检测到甘草次酸产生.

由表1可以看出，甘草内生真菌RE4、RE11转化甘草的效率最高，为了实现甘草次酸的高效率转化，将甘草内生真菌RE4及RE11作为转化菌株，并等量混合后发酵转化甘草，结果甘草次酸的质量比可达3.274 3±0.003 1**△△，结果见图1.

图1 不同菌株转化甘草样品的HPLC 色谱图A—甘草生药；B—RE4-RE11转化甘草样品；C—RE11转化甘草样品；D—RE4转化甘草样品；E—甘草次酸对照品，1—甘草次酸

分析表1及图1的结果，采用甘草内生真菌RE4、RE11分别转化甘草及RE4-RE11混合转化甘草后，甘草次酸质量比明显提高，RE4-RE11混合转化甘草产生的甘草次酸与RE4和RE11分别发酵甘草样品相比，甘草次酸的质量比提高约7.5倍，同生药相比提高约30倍，说明甘草内生真菌 RE4-RE11混合转化甘草能显著提高甘草次酸的产量；同时也说明，甘草内生真菌RE4及RE11混合后再转化甘草时，2株菌株之间也存在着相互的影响，甘草内生真菌RE4及RE11混合转化甘草显著提高甘草次酸质量比的机理还在进一步研究中.

2.2转化工艺优化

在预实验和单因素实验的基础上，筛选出甘草粉(底物)投料质量和培养基体积比(料液比)、内生真菌RE4及RE11混合接种比例、摇床转速及转化时间为主要考察因素，采用正交实验法优选转化工艺，实验结果见表2，方差分析见表3.

表2正交实验结果(n=3)

组别A投料质量与培养基的体积比/(g·mL-1)BRE4-RE11接种比例C摇床转速/(r·min-1)D转化时间/d甘草次酸质量比/(mg·g-1)13∶101∶116043.742823∶102∶118053.561933∶101∶220063.081442∶51∶118063.882952∶52∶120043.163962∶51∶216053.568371∶21∶120053.731681∶22∶116063.528191∶21∶218043.8635K110.38611.35810.83910.770K210.61410.25411.30710.863ΣY=32.124K311.12410.5129.97810.491CT=114.66R0.2460.3680.4430.124

表3方差分析

方差来源离差平方和自由度均方F值显著性A0.09520.04831.7*B0.22220.11174*C0.30420.152101.3**D0.02520.0138.3误e0.003

注：F0.01(2, 2) = 99，F0.05( 2, 2) = 19.00，*表示差异显著，**表示差异极显著

由表2、3直观分析及方差分析可知，影响内生真菌RE4-RE11混合转化甘草生产甘草次酸的因素顺序为：C>B>A>D，即摇床转速>内生真菌RE4-RE11接种比例>投料质量与培养基体积比>转化时间；最终确定最佳转化工艺为：A3B1C2D2，即投料质量与培养基体积比1∶2，内生真菌RE4-RE11接种比例1∶1，摇床转速180 r/min，培养时间5 d.

2.3转化样品中甘草次酸的提取分离结果

从RE4-RE11转化甘草样品中得到白色结晶406 mg，以甘草次酸对照品为对照，通过TLC 检测发现该结晶在与甘草次酸相应的位置显同样颜色的斑点，结果见图2；同时，以甘草次酸对照品为对照，对所得白色结晶进行HPLC/MS 分析，结果见图3，由图3可知，样品经HPLC/MS分离并进行负离子一级质谱扫描后，得到m/z为469.6的准分子离子峰，且该峰与甘草次酸(M=470.7)失去一个氢(M-1=469.7)基本一致，并与甘草次酸对照品HPLC/MS完全一致，从而确定该单体物质即为目标产物甘草次酸.

图2 TLC 检测结果a：甘草次酸对照品，b：结晶物质

图3 HPLC/MS检测结果

甘草经内生真菌RE4及RE11转化后，样品中甘草次酸得率为2.03 mg/g；同法处理甘草生药200 g，得到甘草次酸13.5 mg，与甘草生药相比，甘草内生真菌RE4-RE11混合转化甘草后甘草次酸的产量提高约30倍.

3 结 语

以甘草内生真菌RE4-RE11混合转化甘草后，与甘草生药相比，甘草经转化后甘草次酸产量显著提高，说明采用微生物转化法提高甘草次酸质量比是可行的；同时甘草经菌株转化前后也存在各种活性成分质量比的增减变化，采用微生物转化法提高食品、药品中活性成分质量比是目前研究的热点之一，本文研究结果也再次说明微生物转化法的使用对新型保健食品、新药的研发起到推动作用.甘草内生真菌RE4-RE11混合转化甘草提高甘草次酸质量比的机理正在进一步研究.

对甘草内生真菌RE4-RE11混合转化甘草样品，采用超声提取后进行D101大孔树脂分离，再经过一次硅胶柱层析，得到单体物质，通过TLC 检测和HPLC/MS 检测，确定该单体物质即为目标产物甘草次酸，与甘草生药相比，甘草次酸的得率提高约30倍.该提取分离路线切实可行，可用于工业化生产，为甘草次酸原料的生产提供新方法.

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Improvementofglycyrrhetinicacidyieldinglycyrrhizauralensisbymicrobialtransformation

WANG Yu-qing, SUN Ya-bei, JIAO Jia-chen-qi, ZHENG Chun-ying

(Key Laboratory of Microbiology, School of Life Science, Heilongjiang University, Harbin 150080, China)

A microbial transformation process was intended to be developed for improving the content of glycyrrhetinic acid from glycyrrhiza uralensis in order to provide a new method for the industrial production of glycyrrhetinic acid. Strains RE4 and RE11were selected to convert glycyrrhiza uralensis and the contents of glycyrrhetinic acid were improved specifically, After optimization of the process，the content of glycyrrhetinic acid in glycyrrhiza uralensis was increased to from 0.1283 mg/g in the untreated one to 3.892 9 mg/g，that was the 30.34 times higher than non-conversed samples. Meanwhile, glycyrrhetinic acid was extracted by ultrasonic extraction, and then it was isolated by the macroporous resin and silica gel colomn chromatography. It indicated that microbial transformation of glycyrrhiza uralensis was efficient, less the energy consumption and reduce the production cost and no noise pollution and so on.

glycyrrhiza uralensis; microbial transformation; glycyrrhetinic acid; extraction

2017-03-28.

哈尔滨市科技局优秀学科带头人项目(2014RFXXJ094)；黑龙江省自然科学基金面上项目(H2015003)

王宇晴(1995-)，女，硕士，研究方向：微生物制药研究.

郑春英(1968-)，女，博士，教授，研究方向：微生物制药研究.

R931

A

1672-0946(2017)05-0537-04