基因疗法新希望：神经元靶向病毒

乔斯林·凯泽+梁炳鑫

弗吉尼亚州森特维尔，一个3岁的女孩，名叫伊芙琳，一头红卷发，一脸甜蜜的笑容，穿着紧身衣随着法瑞尔·威廉姆斯的歌曲《快乐》蹦蹦跳跳。

伊芙琳的姐姐约瑟芬15个月时就去世了，她患有Ⅰ型脊髓性肌萎缩（SMA1），这是一种遗传疾病，会逐渐使婴儿瘫痪。怀上伊芙琳也是意外，尽管她也有可能遭受这个不幸，但她的父母还是决定生下她。

伊芙琳于2014年12月出生后不久，她的父母就从基因测试中了解到她也患有SMA1。父亲米兰·维拉里尔说：“我们当时的想法就是，尽可能地给她爱，无论多长时间。”但是那天晚上，他们疯狂地在网上搜索，看到俄亥俄州有一个相关的临床试验，连忙发了一封电子邮件。伊芙琳8周大的时候接受了基因疗法，医生给她提供了一种她自己没有的重要的蛋白质。

现在的她和健康的孩子没什么两样。尽管她的大腿较弱，不能正常跑步或跳跃，但可以快走、跳舞、拼字母、扔泡沫块，还可以搬一把小椅子，爬到母亲埃琳娜的腿上。在失去了第一个孩子之后，维拉里尔惊奇地看着伊芙琳爬、走路和说话。他说：“这简直是个奇迹。她的每一个进步都像是一个里程碑，我们为她的每一个成功开一瓶酒庆贺。”

將基因载体注入静脉

伊芙琳参与的试验结果给基因治疗研究人员留下了深刻的印象，这也是该领域的一个最成功的尝试。根据《新英格兰医学杂志》的一份报告，所有接受SMA1治疗的15名婴儿，现在已经20个月或更大，但仍然活着，多数可以坐起来。一个男孩也像伊芙琳一样能走路了。尽管最近获批用于SMA1的药物也取得了相似的效果，但是必须4个月注射一次。基因疗法的目的是一次性治疗，并将其简单地注入静脉。主持最近试验的哥伦布全国儿童医院神经学家杰里·门德尔说：“基

因疗法对致命疾病的疗效这么好，我从来没有见过。”

这一消息增加了基因疗法的上升势头。由美国食品和药物管理局（FDA）顾问小组批准的一种基因形式的失明治疗正在成为美国第一个被批准用于遗传性疾病的基因疗法。《新英格兰医学杂志》刊登的一个研究报告说，移植男孩自己的基因修饰干细胞可以阻止一种破坏性的脑部疾病。欧洲市场上的一种基因疗法治愈了患有致命性免疫疾病的孩子，另一些正在开发中的药物可以帮助血友病患者使用凝血药物。

SMA1的研究已经起步，它证明了一种新载体的力量，即将一种携带治疗性基因的病毒输入静脉中，使其将承载物运送到中枢神经系统，穿过所谓的血脑屏障。过去，用基因疗法治疗神经系统疾病的努力效果不佳，传递媒介往往需要在患者颅骨上钻孔。现在，科学家在中枢神经系统中获得了无可争议的成功。这些结果也减轻了人们对病毒弥漫血液可能导致另一场悲剧的担忧。18年前基因治疗试验中一名青少年死亡，这使得该领域陷入一片混乱。

新治疗法明显的安全性和成功性使得其他研究人员尝试利用静脉或脊柱进行基因治疗来对付罕见的儿童期神经和肌肉疾病，甚至常见的成人疾病如帕金森氏症。美国宾夕法尼亚州费城基因治疗公司星火治疗公司的首席学术主任费德里科·明戈其说：“它为一个非常谨慎的领域建立了一个全新的概念。”

位于教堂山上的北卡罗来纳大学基因治疗研究员史蒂文·格雷补充说：“回顾一番之后，人们将会把这看作一种新型医学的里程碑，这种新型医学将对许多疾病产生广泛的影响。”

曾经的危险试验

起初的实验对象是动物，那时，用基因治疗神经疾病似乎很轻松。在20世纪90年代，研究人员向新生小鼠的大脑注射携带缺失基因的病毒载体，这些新生小鼠具有某些代谢紊乱。华盛顿大学圣路易斯分校的马克·桑兹回忆说：“结果令人震惊，真是太好了。”但是老鼠的大脑很小，所以他补充说：“难就难在如何将治疗手段从一个仅有半克重的小鼠大脑向重达1000克的儿童大脑放大，这在规模上是2000倍啊！怎样才能做到这一点？”

原来的研究人员办不到。1996年，一个团队将含有治愈性基因的脂肪颗粒注入两名患有脑部疾病（脑海绵变性） 的儿童的头骨中。这项研究是有争议的，而且未能给病人带来什么好处。原来的部分研究人员后来又对13名这种疾病患者进行治疗，在其颅骨上钻了6个孔，注射了一种明显无害的病毒（腺伴随病毒）制成的载体；另一项类似的试验的治疗对象是一种严重的儿童遗传性脑病：巴敦氏症。

然而，这两种治疗都没有太大的作用。研究人员对中国台湾几名因大脑缺乏两种化学物质而严重残疾的儿童进行了一项试验，结果显示出明显的益处，但治疗其他疾病的结果是模棱两可的。对猴子的研究表明，腺伴随病毒载体没有扩散到远离注射部位的区域，因此可能没有足够的脑细胞接受新基因。格雷说：“他们在很多方面都进行了英勇的努力，但技术并不理想。”

一个完全不同的方法取得了神经疾病的唯一成功。研究人员从患者身上采集了血液干细胞，使用修饰的艾滋病病毒将新基因缝合，并将细胞注入患者体内。然后，一些细胞迁移到大脑并形成被称为神经胶质细胞的神经元支持细胞，产生所需的蛋白质。根据《新英格兰医学杂志》发表的一项研究，在15名男孩中，这种“离体”基因疗法阻止了一种被称为肾上腺脑白质营养不良（ALD）的致命疾病，该疾病可破坏神经元周围的髓鞘。意大利基因治疗研究人员已经报告了给脑疾病异染性脑白质营养不良的年轻患者做了类似的治疗。

但是体外基因治疗最适合因缺乏分泌蛋白引起的脑部疾病：移植的细胞可以通过搅动分子来让其他神经细胞捡起来取代它。对于许多疾病，缺失的蛋白质在细胞内起作用，因此所有需要它的细胞必须接受载体。

似乎满足这种需求的病毒载体的故事始于一次死亡。十几年前，这个领域的一位先锋人物、宾夕法尼亚大学遗传学家威尔逊被迫调整研究方向。当时，威尔逊牵头进行1999年的试验，受试者——18岁的杰西·基尔辛格——因大规模免疫反应死于为治疗肝病的强效腺病毒载体。威尔逊在这次试验中有经济利益可图，所以在面临家属的诉讼和食品和药物管理局的调查时，最终他同意5年之内不再进行领先的临床试验。于是，他转而寻找新类型的AAV，它比腺病毒安全，而且已

经成为流行的载体。

2004年，高光平等人在威尔逊实验室报告，他们已经梳理了人类和灵长类动物组织，发现了100多种具有“嗜性”或优先感染特定类型细胞的新型AAV。威尔逊回忆说，一种被称为AAV9的类型“不同于任何其他AAV，以高剂量注入血液时，它遍及各处”，如心脏、肌肉和脑组织。最引人注目的是它能够在神经元上生存，这是治疗许多脑部和脊椎疾病的关键。

其他研究人员争先恐后地确认AAV9对神经系统的钟情。2009年，一个法国团队和布莱恩·卡斯珀发表了不同的论文，刺激了这个领域：对新生小鼠进行静脉注射，AAV9穿越了血脑屏障——保护中枢神经系统免受病原体和毒素侵害的细胞网络——感染了整个脊髓和大脑中的神经元。

再次在人体上进行试验

当国家儿童医院团队准备就绪，要在人体上试验AAV9的时候，他们选择瞄准SMA1，这是婴儿最常见的致命性遗传病因。这样的婴儿缺乏功能SMN1基因，这个基因编码一个蛋白质——生存运动神经元（SMN），终身维持脊髓神经元。大多数人有一个备份基因SMN2的多个副本，可以产生少量的SMN，限制疾病的严重程度。但那些SMA1患者只有两个备份基因，而关键的蛋白质太少了。

生来就患有SMA1的婴儿是软的，不能吸吮或抬头，因为脊髓运动神经元缺失，肌肉减弱，并且在某些时候因不再能自行呼吸而死亡。由卡斯珀牵头的一个团队着手开发AAV9携带SMN基因的治疗方法。他们计划在静脉注射后，用这种方法治疗患有SMA1的新生小鼠，使其具有正常的运动功能和寿命。

但是这可能需要大量的病毒载体。因为肝细胞也是AAV最喜欢的靶标，所以肝脏将部分AAV9注入血液，把剩下的部分留给其他组织。格雷在北卡罗来纳大学的嘉德·萨穆尔斯基指导下做博士后时，他估计只有不到1%的原始剂量穿过了血脑屏障。基于治疗SMA1小鼠所需的量，国家儿童医院团队提出了一种治疗剂量的载体，比基因治疗试验中注射到患者血液中的载体高100倍。

对猴子的测试表明这个剂量是安全的。美国食品及药物管理局和美国国立卫生研究院（NIH）的重组DNA咨询委员会审查了大部分美国基因治疗试验，批准了这项研究，国家儿童医院和一个基金会同意资助这项研究。（由卡斯珀合作创建的名为AveXis的新公司在获得国家儿童医院的治疗许可之后，资助了试验的后期阶段。）

不过，许多基因治疗研究人员屏住呼吸，担心另一个基尔辛格式的灾难。萨穆尔斯基说：“这事让有些人紧张，毕竟对于年龄小的病人来说，这是巨大的病毒载量。”

第一个宝宝接受AAV9治疗的测试剂量后不久，她的肝酶升高到正常值的31倍，表明可能有细胞损伤。门德尔说：“那天晚上我睡得不好。”但是后来孩子的类固醇水平迅速降低了，他说食品及药物管理局劝他继续下去。其他3名婴儿也发生了肝酶升高，但没有肝损伤的临床征兆，试验继续进行。

这个进步不小。这是一个转型变化。这就是我们一直希望的基因疗法。

虽然该试验主要是为测试治疗的安全性而设计的，但是引入的基因减缓了婴儿的萎缩。他们没有变得越来越软，可以挣扎着呼吸，变得强壮了。埃琳娜·维拉里尔回忆说，有一天伊芙琳躺在她的肚子上，抬起了她的头。“这对SMA1患者来说简直是不可能的事。”到目前为止，15名接受治疗的婴儿中只有8名需要佩戴面罩帮助呼吸。接受两种AAV9剂量较大的12人中有11人（其中一个在半岁的时候才得到治疗）至少可以不用大人帮助就能短时间地坐着、吃东西、说话。佛罗里达州迈阿密的一个男孩马泰奥出生后27天就接受了治疗，他父亲德文·阿尔梅达说，现在他可以跑步，而且发育很正常。

马里兰州巴尔的摩市约翰·霍普金斯大学SMA研究员夏洛特·萨姆纳说，这个试验的结果“值得注意”。正在进行的研究中，一种名为纳西尼尔森（nusinersen）的药物，由一束能帮助SMN2基因产生更多蛋白质的RNA组成，这在SMA1患者中也有同样令人印象深刻的作用。2016年12月，该药获得食品及药物管理局批准。萨姆纳指出，基因疗法因为“一劳永逸”，所以具有很大的吸引力。

第二轮研究

治疗能管多久，这还是个未知数。与用于离体基因治疗的HIV和其他病毒不同，AAV不把治疗基因整合到细胞的基因组中，而是把它作为一个自由浮动的DNA循环存放，这意味着当细胞自我复制时，效应可能会丧失。“但是神经细胞并没有分裂，因此被处理的组织应该持续多年生产SMN蛋白。”国家儿童医院基因治疗中心主任凯文·弗拉尼根这样说。

如果基因治疗的益处最终消失，那么SMA1患者将需要再次治疗，而且他们现在具有可能妨碍它的AAV9抗体。但是国家儿童医院的研究人员正在研究反制措施，比如过滤血液中的抗体或者给予某些免疫抑制药物。

另一个长期的擔忧就是癌症。桑兹等人的研究发现，通过IV给新生小鼠注射大剂量AAV9后， 一些AAV可以将它们的DNA整合到基因组中并导致肝癌。桑兹指出，科学家还不知道这些结果是否与人类有关。一些基因治疗医生确信，在过去的基因治疗试验中，数百名接触AAV的患者中没有出现过肝癌。

AveXis已经发起了第二轮治疗SMA1研究，并计划治疗轻一些的病症。如果试验证实了治疗的希望，那么生产足够的药物来满足患者的需求将是一个挑战。但是AveXis的一位发言人说，伊利诺伊州芝加哥附近的一家新工厂应该有能力在美国和欧洲每年生产治疗500个SMA1新生儿的剂量。该公司还没有把价格标签放在治疗上，但这可能是昂贵的——市场上的基因疗法每次治疗费用

高达70万美元。

现在，高剂量系统递送的AAV基因治疗似乎是安全的，国家儿童医院和其他地方的团队正在开展其他神经肌肉病变的试验，其目的就是通过IV向肌肉细胞而不是神经元递送新的基因。

科学家也在探索AAV9的下一个问题：它能否超越帮助脊髓神经元，并达到足够高的水平以深入脑部，从而阻止疾病的发生？第一个结果可能来自正在进行的试验，由阿比欧娜治疗公司赞助，国家儿童医院运营，即使用静脉输送AAV9基因疗法治疗圣菲利波A 型综合征。患有该病的儿童缺乏分解硫酸乙酰肝素所需的酶，该硫酸乙酰肝素是一种积聚在脑中的分子，并在2岁至6岁时引起明显的损害。一年后，3名儿童接受治疗，其脊髓液中的硫酸乙酰肝素水平大幅下降，肝脏肿大缩小，非语言认知测试得分稳定，弗拉尼根在会议上都有报告。

其他试验依赖于AAV9的神经元归巢特性，但通过注入脊髓液直接给予患者的中枢神经系统。这需要比IV 交付更少的病毒，所以制造不会成为一个障碍，对于血脑屏障比婴幼儿发育更为成熟的老年患者也可能更好，而脊柱传递应该减少任何免疫反应。

在这个策略的第一个测试中，NIH的一项试验给了8名患有巨型轴索神经病的病人。一种AAV9病毒载体含有替代基因，用于破坏轴索——神经细胞的冲动传递卷须——并影响大脑。格雷在萨穆尔斯基实验室的动物研究奠定了试验的基础，他说现在报告结果还为时尚早。但纽约雷克斯福德的洛里·萨麦斯的慈善机构汉娜希望基金支持格雷的研究。她说，她轮椅上13岁的女儿汉娜于

2016年7月接受了治疗，目前已经有所改善：她的视力下降已经稳定下来，可以自己吃东西，并且能够在帮助下站起来。她说：“看到这些，我们真的很满意。”

对SMA 1和其他进行性疾病的患者来说，及早治疗至关重要。纽约罗切斯特大学医学中心儿科神经学家乔纳森·闵克说：“一旦神经元消失了，它们就没了。”目前，已经患有这些遗传疾病的儿童的兄弟姐妹最有可能被较早发现，并接受预防性治疗。但是患者群体正在敦促将ALD和SMA等疾病加入新生儿筛查试验中，这样可以扩大治疗范围。

有些研究人员仍然怀疑，提供AAV9的新的侵入性较小的方法是否能够到达足够多的脑细胞。纽约威尔·康奈尔医学中心的罗纳德·克里斯托表示：“我怀疑它会广泛地应用于其他疾病。”特别是在年长的孩子身上。他做过通过颅骨送入的方式治疗巴敦氏症。

其他基因治疗医生正寄希望于寻找能够穿越血脑屏障的新型AAV载体。加州理工学院帕萨迪纳分校的一个小组已经确定了几个，其中包括一个AAV变种，它穿越屏障比小鼠中的AAV9有效40倍。马萨诸塞州剑桥的航海家医疗公司表示，这些载体在猴子身上似乎也起作用，尽管这些数据仍未公布。

令人兴奋的是，基因治疗医生正在观察，看看同样的策略是否能够拯救更多患有严重遗传疾病的孩子。如果确实如此，那么基因治疗在药物库中的地位将得到保证。威尔逊说：“这个进步可不小。这是一个转型变化。这就是我们一直希望找到的基因疗法。”