藻蓝蛋白对家兔心肌缺血-再灌注损伤的影响

杨莎莎，周 利

（十堰市太和医院湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 442000）

·实验研究·

藻蓝蛋白对家兔心肌缺血-再灌注损伤的影响

杨莎莎，周 利*

（十堰市太和医院湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 442000）

目的 研究藻蓝蛋白对家兔心肌缺血-再灌注损伤模型的影响。方法 家兔60只,采用随机数字表编号后随机分为假手术组，缺血-再灌注组,藻蓝蛋白1、2、3组,除假手术组外均建立心肌缺血-再灌注损伤模型。成模后2 h,藻蓝蛋白1、2、3组用藻蓝蛋白混悬液50 、200、400 mg/（kg·d）灌胃2周,假手术组和缺血-再灌注组灌等体积生理盐水对照。采用酶联免疫吸附测定法检测2 周时家兔各组大鼠血清中肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、内皮素-1（ET-1）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）及心肌组织丙二醛（MDA）;免疫组化染色检测诱导型一氧化氮合酶（iNOS）阳性表达;反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测缺血区血管内皮生长因子（VEGF） mRNA的表达。结果 藻蓝蛋白2、3组 NO 和SOD、eNOS明显提高, iNOS阳性细胞数增多, 缺血区组织VEGF、VEGFmRNA高表达, ET-1、CK-MB和心肌MDA显著降低,与模型组比较（P ＜ 0.05）,差异有统计学意义。结论 藻蓝蛋白对家兔心肌缺血-再灌注损伤有保护作用。

家兔;藻蓝蛋白;酶;缺血-再灌注损伤;血管内皮生长因子

心脏疾病的致死主因多为心肌缺血-再灌注损伤，在抢救和治疗过程中，缺血区心肌在恢复血供后，由于清除自由基的抗氧化酶SOD合成障碍及氧自由基大量产生，常造成严重的缺血-再灌注损伤及心肌细胞不可逆损伤[1]。随着心肌细胞凋亡、坏死及线粒体功能障碍，ET-1大量产生，NOS活性降低，最终导致血管内皮合成和释放NO不足，造成拮抗ET-1作用减弱，血管内皮细胞完整性遭受严重破坏[2]。而使用SOD等自由基清除酶可减轻缺血-再灌注造成的组织损伤[3]。藻蓝蛋白具有抗氧化活性、抗炎、抑制脂过氧化物生成等作用[4]。有研究发现其对脑缺血-再灌注损伤有防治作用，本实验选用家兔心肌缺血-再灌注损伤模型，研究其对心肌缺血-再灌注损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 普通级雄性家兔60只，周龄8周，体质量(1.8±0.1) kg，采用随机数字表编号后随机分为假手术组，缺血-再灌注组，藻蓝蛋白1、2、3组，每组12只。家兔购自湖北省实验动物中心。

1.2 仪器与试剂 TKR-200C小动物呼吸机(上海寰熙医疗器械有限公司)；BL-420F生物机能记录仪（成都泰盟）；藻蓝蛋白（浙江宾美生物科技有限公司）；戊巴比妥钠（德国分装）；MDA、SOD、CK-MB测试盒（南京建成生物工程研究所）；VEGF 及VEGFmRNA测试盒（成都荣海生物试剂有限公司）

1.3 造模及治疗 腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉家兔，除假手术组外，其他4组采用丝线结扎左冠状动脉前降支缺血30 min再灌注30 min，反复缺血-再灌注的方法建立心肌缺血-再灌注损伤模型。假手术组不结扎，30 min后关闭胸腔。胸腔关闭后即行治疗。藻蓝蛋白1、2、3组分别用50、200、400 mg/(kg·d)藻蓝蛋白混悬液灌胃2周，假手术组和缺血-再灌注组灌等体积生理盐水对照。

1.4 检测指标及方法 采用酶联免疫吸附法测定CKMB 、SOD、NO 、MDA、eNOS和 ET-1。免疫组化染色检测eNOS阳性表达细胞[5]。实时荧光PCR法检测缺血区组织VEGFmRNA表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0分析软件，数据以均数±标准差表示，多组间比较先进行方差分析，组间差异则采用两样本均数Dunnett检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 家兔心肌及冠状动脉病理组织切片观察 缺血-再灌注组肌纤维肥大、心肌纤维纵横纹模、有溶解、断裂及脂肪样变性。冠状动脉血管管壁损伤、狭窄、血管内皮有剥脱并有新生内膜、边缘呈 “峰-谷”等典型理性血管重构现象，而假手术组均无以上病理改变，说明造模成功。藻蓝蛋白2、3组家兔心肌纤维相对缺血-再灌注组纵横纹清晰、整齐，但肌纤维间质仍有少量细胞增生、肥大。冠状动脉管腔增大、血管无内皮剥脱、边缘无“峰-谷”现象，新生内膜较缺血-再灌注组减少82%，病理性血管重构现象明显好转。

2.2 对家兔eNOS、NO、ET-1的影响 见表1。

2.3 对家兔心肌细胞中iNOS表达的影响 见表2。

表1 家兔eNOS、NO、ET-1水平比较（x± s,n = 12）

表2 家兔心肌细胞中i NOS阳性细胞数比较（x± s ，n = 12） 个/100

2.4 藻蓝蛋白对家兔酶等相关生化指标的影响 见 表3。

表3 家兔SOD、MDA、CK-MK水平比较（x± s,n = 12）

2.5 藻蓝蛋白对家兔心肌血管内皮生长因子表达的影响 见表4。

表4 家兔VEGF和VEGFmRNA表达比较（x± s,n = 12）

3 讨论

本实验病理观察发现，藻蓝蛋白2、3组较缺血-再灌注组病理性血管重构现象明显好转，NO 、SOD和eNOS明显提高，iNOS阳性细胞数增多，冠状动脉VEGF、VEGFmRNA高表达， ET-1、CK-MB和心肌MDA显著降低，提示藻蓝蛋白具有心肌缺血-再灌注损伤的保护作用。

NO是一种血管内皮功能调节因子，iNOS 和eNOS为NO限速酶，两者均主要在心肌细胞和血管内皮细胞中表达，故其活性的改变将影响NO的生成，对血管内皮功能具有调节作用[6-8]。藻蓝蛋白可能通过提高eNOS和iNOS来调节NO的生成，增加NO合成有利于减轻血管内皮损伤。SOD是清除脂质过氧化产物MDA的重要的酶，CK-MB在心肌缺血梗死可反映心肌缺血的严重程度[9]。藻蓝蛋白2、3组SOD明显提高，提示藻蓝蛋白具有肯定的清除自由基、抑制脂质过氧化反应产物MDA 及细胞坏死产物CK-MB的作用，MDA降低是藻蓝蛋白提高SOD活性的直接结果。ET-1对于维持血管正常结构具有重要作用，其降低有利于维持缺血心肌和血管的正常结构，减轻缺血-再灌注血管病理性重塑，VEGF可促进血管内皮细胞分化增殖，促进血管新生[10-12]。藻蓝蛋白2、3组ET-1显著降低，VEGF、VEGFmRNA高表达，提示藻蓝蛋白具有降低ET-1、促使VEGF的调节通路开放，使缺血区大量血管新生，这有利于提高缺血区血供，减轻心肌缺血-再灌注损伤。

[1]吴晓燕,苗琳,郑蕊,等. 心肌缺血再灌注损伤的研究进展[J].中国临床药理学杂志, 2016, 12(11):1043-1045.

[2]陈慧娟,刘金东.线粒体动力相关蛋白Drp1与心肌缺血再灌注损伤机制的研究进展[J].生理科学进展, 2016,10(5):369-374.

[3]余帆,徐彤彤, 吕祥威,等.血清SOD、MDA、MPO检测在心肌缺血再灌注损伤治疗中的应用价值[J].中国老年学杂志, 2013, 10(1):218-220.

[4]夏冬,孙军燕,刘娜娜,等.藻蓝蛋白抗氧化作用及其药理活性研究进展[J].海洋科学, 2015, 39 (7) :130-135.

[5]沈卫,马璇,刘琳,等.藻蓝蛋白对2型糖尿病大鼠心肌细胞内iNOS表达影响[J].青岛大学医学院学报, 2010,46(4):283-285.

[6]王晓敏,高增光,席晓甜,等. 红花黄色素注射液对急性心肌梗死模型大鼠低氧诱导因子和血管内皮生长因子的影响[J].医药导报, 2016, 35(6):570-573.

[7]胡一冰,林玉琳,赵艳芝,等. 国外心肌缺血/再灌注引发的细胞凋亡的治疗研究进展[J].中国医药导报, 2013, 10(5)32-34 .

[8]刘昭娅,胥茜,唐义信,等.内皮型一氧化氮合酶活性的调节与心血管疾病的研究进展[J].中南大学学报(医学版),2016, 41(61):632-636.

[9]胡春丽.血清 cTnI、MYO、CK-MB 联合检测在急性心肌梗死诊断中的应用 [J].临床医学, 2014, 34(3):38-39.

[10]褚现明,冷敏,安毅,等. 藻蓝蛋白抑制血管平滑肌细胞过度增殖性管腔狭窄的机制研究[J].中国药理学通报,2012, 28(10):1383-1388.

[11]王俊东,崔勇,王建国,等. 人参皂苷Rh3预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌组织中caspase-3的作用[J].长春中医药大学学报, 2017, 33(1):13-15.

[12]陈少秀,张秋芳,何华琼,等. 丹参酮ⅡA保护大鼠肾移植术后缺血再灌注损伤的机制研究[J].长春中医药大学学报, 2017, 33(1):21-24.

Effects of phycocyanin on myocardial ischemia reperfusion injury in rabbits

YANG Shasha, ZHOU Li*
（Department of Nephrology, Taihe Hospital, Hubei University of Medical, Shiyan 442000, Hubei Province, China)

Objective To investigate the effect of phycocyanin on myocardial ischemia-reperfusion injury in rabbits. Methods 60 rabbits were randomly numbered and divided into sham operation group, ischemia reperfusion group and phycocyanin groups1,2,3, myocardial ischemia-reperfusion injury models were established in rabbits except the sham operation group. After modeling for 2 h, the three phycocyanin groups were treated by different dose of phycocyanin suspension of 50, 200, 400 mg/ (kg·d) by gavage for 2 weeks; the sham operation group and ischemia reperfusion group were given the same volume of saline as control. The ELISA assay was used to test the level of MB isoenzyme of CK (CK-MB), nitric oxide (NO), superoxide dismutase (SOD) activity, endothelin -1 (ET-1), endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and malondialdehyde (MDA) in rabbit serum; the positive expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) was detected by the immunohistochemical staining; reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the mRNA expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in ischemic regions. Results In the phycocyanin group 2 and group 3, the expression level of NO, SOD and eNOS signif i cantly increased, and the number of iNOS positive cells also increased; in the ischemic tissues, the high expressions of VEGF can be detected, but the expression level of ET-1, CK-MB and MDA signif i cantly decreased compared with the modelgroup (P＜0.05), the difference was statistically signif i cant. Conclusion The phycocyanin has protective effects on myocardial ischemia reperfusion injury in rabbits.

rabbit; phycocyanin; enzyme; ischemia-reperfusion injury; vascular endothelial growth factor

R285.5

A

2095-6258(2017)06-0868-03

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.06.003

湖北省科技厅资助项目（15Y29）。

杨莎莎（1984 -）,女,大学本科,主要从事肾病研究。

*通信作者：周 利,女, 电话 - 18772853929,电子信箱 - yssyangsasajob@126.com

2017-03-07）