响应面法优化酒醅中风味物质水蒸汽提取工艺

洪 胜，郭亚飞，袁 晔，李 喆，黄永军

（江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800）

响应面法优化酒醅中风味物质水蒸汽提取工艺

洪 胜，郭亚飞，袁 晔，李 喆，黄永军

（江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800）

通过单因素及Box-Behnken设计实验对酒醅中的风味物质成分的水蒸汽提取工艺进行了优化，优化目标为酒醅水蒸汽提取馏分气相色谱图谱与车间原酒图谱相似度，并在最优提取工艺条件下通过酒醅加标回收实验分别获得了酒醅中7种原酒骨架成分的平均回收率。结果表明，酒醅中风味物质水蒸汽提取优化工艺参数为：提取溶剂150 mL，馏分体积15 mL，提取溶剂乙醇浓度17%，此条件下相似度实测值为（92.0±4.2）%。酒醅中7种原酒骨架成分的平均回收率分别为乙酸乙酯84.6%、丁酸乙酯81.0%、己酸乙酯72.6%、乳酸乙酯56.8%、乙酸56.1%、丁酸50.9%、己酸36.4%。

响应面； 酒醅； 水蒸汽提取

中国传统白酒是以粮谷类为原料，酒曲为糖化发酵剂，采用固态发酵方式，经蒸馏、贮存、勾调形成的酒精饮料[1]。酒醅是酿酒原料经酿酒微生物混合发酵的物料，微生物在发酵过程中产生多种风味物质，是影响白酒产质量的关键因素。目前对于酒醅的研究多集中于其常规理化及微生物指标，而对其所含微量风味物质的研究相对较少，这就大大限制了对于酒醅发酵质量与对应原酒产质量关系的研究，究其原因主要在于对酒醅中不同性质的风味物质的提取较为困难。

目前已有针对酒醅中风味物质提取研究的相关报道，如顶空-固相微萃取[2-3]、溶剂辅助风味物质蒸发[1]、索氏提取[4]以及水蒸汽提取工艺[5-6]等。水蒸汽提取工艺是化工中分离挥发性物质的一种高效精馏方法，普遍用于有机物的精馏分离过程。白酒生产中采用水蒸汽提取工艺，故实验室采用水蒸汽提取工艺不仅能模拟车间生产过程，且提取样品的风味成分更接近真实酒样，但目前鲜有针对酒醅水蒸汽提取工艺优化的研究报道。

酒醅中所含风味物质种类众多，且性质（如分子量、沸点等）及含量差异极大，而原酒中具有相对稳定的风味物质组分种类及含量，如实验室采用水蒸汽提取工艺获得的馏分样品在风味物质种类和含量上能最大程度接近原酒，从生产应用角度可认为提取工艺达到最优。为准确度量馏分样品与车间原酒相似程度，引入了指纹图谱技术，指纹图谱即将经预处理的样品，通过色谱手段分析后得到的能显示该样品特性的谱图，该技术只需将样品中各种成分的含量和比例关系以色谱图予以呈现，并采用相似度指标比较样品之间差异，其计算一般采用“相关系数法”或“夹角余弦”法，但结果基本一致[7]。

本研究采用响应面法对酒醅中风味物质的水蒸汽提取工艺进行了优化，优化因素为提取溶剂体积、馏分体积及提取溶剂组成，优化目标为馏分样品气相色谱图谱与车间原酒图谱相似度（下简称相似度），确定最优提取工艺参数，并通过加标回收实验确定原酒骨架成分回收率，以期为酿酒生产中酒醅风味成分分析提供有效的提取工艺，同时也为从风味成分角度探索酒醅和原酒之间的相关性提供了可能性，从而更准确的分析酒醅发酵情况。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

实验材料：2017年5月洋河酒厂浓香型出池酒醅；建立对照指纹图谱用不同批次50个原酒样品，分别取自该公司2016年9月—2017年5月多个浓香型生产车间不同小组。

主要实验试剂：乙醇（国药集团化学试剂有限公司，AR）；叔戊醇（内标1，纯度≥99%，中国医药（集团）上海化学试剂公司）；乙酸正戊酯（内标2，纯度≥98.5%，中国医药（集团）上海化学试剂公司）；2-乙基正丁酸（内标3，纯度＞99%，德国Merck Schuchardt公司）；乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、丁酸、己酸（纯度均≥99.5%，美国Sigma-Aldrich公司）。

主要仪器设备：Agilent 7890A型气相色谱仪（安捷伦科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 气相色谱分析条件

载气N2，流速1 mL/min；进样口温度270℃，进样量 1 μL，分流比 50∶1；CP-Wax 57CB 型（CP-97723A）毛细管色谱柱，50 m×0.25 mm×0.25 μm；程序升温，35℃保留6 min，6℃/min升至60℃，保留3min，再以4.5℃/min升至80℃，保留2min，9.5℃/min升至180℃，保留2 min，9.5℃/min升至210℃，保留10 min；FID检测器，300 ℃，氢气30 mL/min，空气300 mL/min。

1.2.2 对照指纹图谱的建立及相似度计算

50个原酒样品气相色谱直接进样，对所有样品图谱中所含的43个共有峰（包含1.1节所述7种骨架成分）进行积分，并将原始数据文件转化为AIA格式，一并导入中药指纹图谱相似度评价系统，生成共有模式图谱作为酒醅水蒸汽提取样品相似度评定对照指纹图谱。对照指纹图谱建立后，将不同提取条件得到的酒醅馏分样品色谱分析数据导入该系统，与对照指纹图谱进行比对，计算并获得相似度结果。

1.2.3 单因素实验

准确称取50 g酒醅样品置于500 mL 3个球形烧瓶中，加入一定体积、一定比例的乙醇溶液，振荡均匀后通入水蒸汽提取，自来水冷凝回流，收集一定体积馏分，气相色谱直接进样检测其中的风味物质成分。具体实施步骤如图1，依次研究提取溶剂体积、馏分体积和乙醇浓度3个因素对相似度的影响，每个单因素实验设置3个平行。

1.2.4 水蒸汽提取工艺优化

以单因素实验结果为基础，确定溶剂体积、馏分体积和乙醇浓度3个因素作为考察变量，采用3因素3水平的Box-Behnken设计优化实验，以相似度为优化目标，实验因素及编码水平见表1。

1.2.5 原酒骨架成分水蒸汽提取回收率测定

在装有50 g酒醅的3个烧瓶中加入一定体积和浓度的原酒7种骨架成分（乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、丁酸、己酸）混合标准溶液（加标液体积及浓度见表4），密闭过夜，次日按照优化得到最优提取工艺实施水蒸汽提取过程，并设空白对照（未加标酒醅样品），各设置3个平行。

表1 影响相似度三因素及其编码水平

1.2.6 数据分析

响应面优化设计及统计分析软件为Design-Expert 7.0.0，相似度评价软件为中药指纹图谱相似度评价系统2004 A版。

2 结果与分析

2.1 水蒸汽提取单因素对相似度的影响

不同溶剂体积、馏分体积及乙醇浓度对相似度影响见图1。随着提取溶剂体积增大，相似度呈先增后减趋势，溶剂体积增大，促进水蒸汽与酒醅间的传质、传热过程，风味物质加快析出至馏分中，使相似度增大，但溶剂体积过大会导致体系升温速率减缓，一定馏分体积下风味物质成分及含量减小，相似度减小。实验室使用的提取酒醅量较少，在蒸汽量充足及提取溶剂量一定的前提下，酒醅中的挥发性成分较大部分在较短时间内馏出，致使在馏分体积为10 mL上下时即达到风味物质种类和含量最大，相似度最高，随后逐渐减小。提取溶剂中乙醇的加入极大促进了风味物质的馏出，相似度急剧上升，但乙醇添加比例试验表明，适宜的乙醇比例非常关键，乙醇浓度在10%vol～30%vol之间相对适宜。综合图1选定影响馏分与对照原酒相似度三因素的有效范围：溶剂体积50～200 mL，馏分体积10～50 mL，乙醇浓度10%vol～30%vol。

2.2 水蒸汽提取工艺优化

2.2.1 Box-Behnken实验结果

基于Box-Behnken设计的优化实验结果见表2，其中含12组析因点实验，3组中心点重复实验用于评估实验误差。

2.2.2 模型方程的建立与显著性评价

图1 单因素实验结果

表2 Box-Behnken优化设计实验结果

运用Design-Expert软件对表2 Box-Behnken实验结果进行多元回归拟合，得到水蒸汽提取酒醅中风味物质的数学模型（已编码）：Y=84.77+5.78 X1-10.45 X2-5.11 X3-3.77 X1X2-2.80 X1X3+5.67 X2X3-15.28 X12-9.15X22-14.99 X32，其中Y为相似度编码值，X1、X2和X3为溶剂体积、馏分体积和乙醇浓度编码值。回归模型显著性方差分析见表3。

由表3可知：（1）该模型方程F值为7.22，对应P值（0.0009）小于0.01，表明该模型极显著；（2）决定系数R2值为0.9807，表示馏分与原酒相似度实验值与模型预测值有良好一致性；（3）模型中X1X2和X1X3项表现为不显著，可简化模型方程Y=84.77+5.78 X1-10.45 X2-5.11 X3+5.67 X2X3-15.28 X12-9.15X22-14.99 X32；（4）3个影响因素对相似度影响大小为馏分体积＞溶剂体积＞乙醇浓度。

2.2.3 响应面分析

图2为响应面及其等高线图，分别反映出各独立变量及其两两之间的交互作用对相似度的影响。图2中a1和b1分别表示固定乙醇浓度为20%vol时，馏分体积和溶剂体积两因素对相似度的影响，a1反映出馏分体积对相似度的影响比溶剂体积大，b1等高线图呈现近似椭圆，表明馏分体积和溶剂体积可能存在交互作用，但模型方程显著性分析显示其P值为0.0918，交互作用不显著。

图2中a2和b2分别表示固定馏分体积为30 mL时，乙醇浓度和溶剂体积两因素对相似度的影响，由a2可看出，溶剂体积对相似度的影响较乙醇浓度大，b2等高线图表现为完整的圆形，这两个因素不存在交互作用，模型方差分析也得到相同结果。

图2中a3和b3分别表示固定溶剂体积为125 mL时，乙醇浓度和馏分体积两因素对相似度的影响，a3显示馏分体积对响应值的影响较乙醇浓度大，b3等高线图呈现为椭圆形，该两因素存在交互作用，契合模型方差分析结果。

表3 回归模型显著性方差分析

2.2.4 最优提取条件验证

图2 溶剂体积、馏分体积和乙醇浓度对馏分与原酒相似度影响响应面图及等高线图

运用Design-Expert软件对建立的模型方程进行寻优分析，得到相似度最高的水蒸汽提取工艺：溶剂体积148.36 mL，馏分体积15.21 mL，乙醇浓度16.60%vol，此工艺下预测相似度为90.4%。考虑到实际操作过程，将上述工艺条件调整为：溶剂体积150 mL，馏分体积15 mL，乙醇浓度17%vol，并进行了该条件下的3次平行验证实验，实际测得相似度为（92.0±4.2）%，与预测值相对误差仅为1.8%。

表4 原酒中7种骨架成分水蒸汽提取加标回收结果

2.3 原酒骨架成分水蒸汽提取回收率

在最优水蒸汽提取工艺条件下酒醅中7种原酒骨架成分的加标回收结果见表4。7种成分加标回收率随着其沸点的升高而降低，最大和最小值差距达48.03%，其原因在于最优提取工艺条件设定馏分体积为15 mL，沸点低较沸点高的风味物质成分优先馏出。根据回收率结果可间接推算酒醅中上述7种成分的含量，从而可为研究酒醅发酵质量与对应酒体风味关系积累数据。

3 结论

采用水蒸汽提取工艺提取酒醅中的多种风味物质组分，以提取得到的酒醅馏分样品气相色谱图谱与车间原酒图谱相似度为优化目标，运用Box-Behnken响应面设计优化酒醅水蒸汽提取工艺参数，包括提取溶剂体积、馏分体积和提取溶剂乙醇浓度，获得酒醅中风味物质成分最优水蒸汽提取工艺为溶剂体积150 mL，馏分体积15 mL，乙醇浓度17%vol，模型相似度预测值为90.4%，3个平行验证实验值为（92.0±4.2）%。最优提取工艺条件下酒醅加标回收实验结果显示：酒醅中7种原酒骨架成分平均回收率分别为乙酸乙酯84.6%、丁酸乙酯81.0%、己酸乙酯72.6%、乳酸乙酯56.8%、乙酸56.1%、丁酸50.9%、己酸36.4%，通过回收率数据计算其在酒醅中的含量分别为4.41 mg/50 g、0.24 mg/50 g、4.65mg/50g、12.91mg/50g、5.23mg/50g、1.06mg/50g、3.02 mg/50 g。从发展角度看，酒醅中风味物质成分提取工艺及其含量的初步确定不仅为实际生产过程中酒醅的质量控制提供了一个有价值的指标，也为后期研究酒醅与对应原酒中风味物质的关系提供了数据支持。

[1]宫莉莉,李安军,孙金沅,等.溶剂辅助风味蒸发法与顶空-固相微萃取法结合分析白酒酒醅中挥发性风味成分[J].食品与发酵工业,2016,42(9)：169-177.

[2]尚柯,韩兴林,王德良,等.酱香白酒高温堆积酒醅挥发性风味物质的检测分析[J].中国酿造,2016,35(2)：139-143.

[3]范文来,徐岩.应用HS-SPME技术测定固态发酵浓香型酒醅微量成分[J].酿酒,2008,35(5)：94-98.

[4]胡沂淮,蔡楠,戴源,等.浓香型白酒堆积发酵酒醅挥发性成分分析[J].酿酒科技,2014(3)：93-96.

[5]周新虎,陈翔,杨勇,等.浓香型白酒窖内参数变化规律及相关性研究（Ⅲ）：风味物质[J].酿酒科技,2012(6)：47-51.

[6]崔海灝,崔靖靖.十里香发酵酒醅中风味物质、酶活力和微生物的关系探讨[J].酿酒,2013,40(6)：74-76.

[7]祝成,张宿义,赵金松.指纹图谱在白酒分析及质量控制中的应用[J].中国酿造,2011(11)：17-20.

Optimization of Steam Distillation Extraction of Flavoring Compounds from Fermented Grains by Response Surface Method

HONG Sheng,GUO Yafei,YUAN Ye,LI Zhe and HUANG Yongjun
(Yanghe Distillery Co.Ltd.,Suqian,Jiangsu 223800,China)

The steam distillation extraction conditions of flavoring compounds from fermented grains were optimized by single factor test and Box-Behnken design.The goal of the optimization was the similarity between GC spectrum of the distillate from fermented grains by steam distillation extraction and GC spectrum of base liquor in workshop.The optimum extraction conditions were summed up as follows:the extraction solvent volume was 150 mL,extraction sample volume was 15 mL,ethanol concentration of extraction solvent was 17%,and the final similarity was(92.0±4.2)%.Under the optimal extraction conditions,the average recoveries of seven kinds of base liquor skeleton components in fermented grains were obtained respectively by recovery test as follows:84.6%(ethyl acetate),81.0%(ethyl butyrate),72.6%(ethyl hexanoate),56.8%(ethyl lactate),56.1%(acetic acid),50.9%(butyric acid),and 36.4%(caproic acid).

response surface method;fermented grains;steam distillation extraction

TS262.3；TS261.4；TS261.7

A

1001-9286（2017）12-0055-05

10.13746/j.njkj.2017206

2017-07-25

洪胜（1985-），男，硕士，主要从事白酒风味物质检测工作。

优先数字出版时间：2017-10-13；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20171013.1352.006.html。