发酵床养猪的安全性评定

郭定章，廖天利，龚维，冉莉，张力力

（重庆市黔江区畜牧兽医局，重庆 黔江 409000）

发酵床养猪的安全性评定

郭定章，廖天利，龚维，冉莉，张力力

（重庆市黔江区畜牧兽医局，重庆 黔江 409000）

为评估微生态发酵床养猪技术在生产中的安全性，本试验在某养猪场分别采集发酵床的表层、中层、深层垫料样品，对其中的大肠杆菌进行分离、鉴定，并进行小白鼠致病性试验。结果显示：从发酵床垫料中分离到的6株大肠杆菌都具有致病性，可见微生态发酵床养猪模式存在一定的安全隐患。

发酵床；养猪；安全性评定

发酵床养猪是控制畜禽粪便排放与污染的一种养殖模式[1]，其原理是采集筛选出自然环境中的多种有益微生物，再以大接种量与猪粪中正常菌群构成发酵床的优势菌群，以锯末、稻壳等材料为发酵垫料，在发酵床原位降解、消纳粪尿。有人认为该技术具有成本低、耗料少、效益高、操作简单、无污染等优点，主张推广应用该技术[2]，但实际生产中，发酵床养猪患病的可能性较高，是否与发酵垫料中的微生物有关有待进一步论证。为了评估发酵床养猪技术的安全性和科学性，本试验对养猪发酵床中的主要病原菌——大肠杆菌进行了分离鉴定。

1 材料

1.1 样品 发酵床垫料采集自重庆市黔江区某猪场。

1.2 主要试剂 麦康凯培养基、普通营养琼脂培养基、LB培养液、革兰氏染液。

1.3 实验动物 ICR小鼠，4～6周龄，18～22g，由西南大学荣昌校区提供。

1.4 主要仪器 生化鉴定管、超净工作台、恒温培养振荡器、高压灭菌锅、高倍显微镜、恒温培养箱。

2 方法

2.1 样品采集 采用五点采样法，分别在发酵床1和发酵床2内各自不同位置的5个点，采集垫料表层、中层、深层的垫料样品各10g，然后将相同层级的样品混合在一起装入灭菌瓶内。

2.2 样品处理 分别在6 mL LB培养液中加入1 g垫料样品，37℃温箱中培养12h。

2.3 鉴别培养 将LB培养液中培养的菌液分别划线接种于麦康凯培养基、普通营养琼脂培养基，37℃温箱中培养24h。

2.4 纯化培养 从麦康凯琼脂平板上挑取单个砖红色疑似菌落，然后移植于普通琼脂培养基上37℃培养 18～24h，重复2～3次，达到纯化的目的。

2.5 细菌鉴定 将分离纯化的不同菌株分别进行革兰氏染色和生化反应试验，革兰氏染色和生化特性检测按参考文献[3]进行，根据镜检的细菌形态和大小，以及生化反应试验结果，并结合该菌株在不同培养基上的生长特征进行鉴定。

2.6 细菌致病力检测 将分离纯化的细菌于LB培养基中增菌培养12h，然后分别用灭菌的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤为混悬菌液，浓度为 1×108～2×108CFU/mL。将每种混悬菌液腹腔注射5只小白鼠（0.2mL/只），对照组小白鼠注射等量的灭菌生理盐水，观察记录小白鼠的发病死亡情况。死亡的小白鼠立即剖检，无菌采集其肝脏和心血，划线于普通平板进行接种菌回收试验，从培养特性、形态、染色特征几方面进行判定。

3 结果

3.1 菌落特征 麦康凯培养基上长有红色、圆形、光滑、湿润、中央隆起、中等大小的菌落，在普通营养琼脂培养基上长出灰白色、圆形、稍隆起、光滑、湿润、边缘整齐的中等大小菌落（直径约1～2mm）。染色镜检后发现呈革兰氏阴性、两端钝圆、中等大小的杆菌。将培养特征和镜检特征比对分析，认为分离到6株疑似大肠杆菌菌株[4]。根据垫料采集位置及发酵床号数分别编号为表 1、中 1、深 1 和表 2、中 2、深 2（下同）。

3.2 生化鉴定结果 6株疑似大肠杆菌菌株的生理生化鉴定结果见表1。将6株疑似菌株的生理生化试验结果与大肠杆菌生理生化特性进行比对[4]，确定分离到的6株细菌均为大肠杆菌。

表1 细菌生理生化鉴定结果

3.3 致病性试验结果 将分离到的6株细菌对30只小白鼠进行毒力试验，24 h后试验组小白鼠共有20只死亡，对照组小白鼠无死亡。

剖检死亡小白鼠，可见其胃肠膨胀，肠腔内充满黄色的水样稀粪，肠道弥漫性出血，因此判断这6株细菌具有致病性。采集死亡小白鼠病料进行菌株回收试验，用麦康凯培养基37℃培养24h，结果在平板上形成粉红色或砖红色、表面光滑、圆形、隆起、湿润和中等大小的菌落，经镜检和生理生化鉴定为大肠杆菌[5]。

在以上发酵床垫料中，从表层分离的大肠杆菌致死率高达100%，从中层和底层分离的大肠杆菌致死率都为50%。

4 小结与讨论

发酵床源于日本，在韩国、新西兰、荷兰得到研究和应用，并取得了成功。本试验涉及的黔江某猪场于2008年开始以发酵床模式养殖生猪，在近几年养殖过程中不断发生一些腹泻、呼吸困难等疾病，造成了严重的经济损失。本试验对该猪场几个发酵床的垫料进行了细菌的分离鉴定，最终获得了6株致病性大肠杆菌。新建发酵床中本身及蓄积的病原体较少，对猪的影响不显著，这可能是现有部分报道称发酵床养猪发病率较低的主要原因[6]。但是当发酵床使用了1～2年甚至更长时间后，发酵床的粪便处理效果降低，多批猪群排出的病原菌就会大量蓄积在发酵床中，从而威胁生猪健康。

有学者认为，微生物发酵床通过微生物发酵使垫料里层温度高达60～70℃，可以杀灭或抑制细菌、病毒繁殖，从而有利于生猪健康生长。但生产上并非所有发酵床都能达到或长期保持60～70℃高温，表层的温度肯定会低于中层和底层，这就导致表层的大肠杆菌数量和毒性高于中层和底层。本试验分离到的6株大肠杆菌，对小白鼠的平均致死率为66.7%，其中表层菌株的致死率高达100%，中层和底层的致死率均为50%。本试验表明发酵床养猪存在一定的安全隐患。■

[1] 刘小丽，张伟.生态养猪法中发酵床的制作方法[J].养殖技术顾问，2011（2）：18.

[2] Gadd J.Unnel housing of pigs in livestock environment IV[A]∥Fourth international symposium michigan[C].Michigan：American Society of Agricultural Engineers，1993：1040-1048.

[3] 姚火春.兽医微生物学实验指导[M].北京：中国农业出版社，2006：36-42.

[4] 陆承平.兽医微生物学[M].北京：中国农业出版社，2007：99-107.

[5] 李学伍，张改平，邓瑞广，等.仔猪大肠杆菌病流行菌株的分离与鉴定[J].河南农业科学，2000（8）：28-30.

[6] 朱洪，常志州，叶小梅，等.基于畜禽废弃物管理的发酵床技术研究[J].农业环境科学学报，2008，27（1）：354-358.

Safety Evaluation of Fermentation Bed for Pigs Breeding

Guo Dingzhang，Liao Tianli，Gong Wei，et al.

（Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Qianjiang District ，Chongqing Qianjiang 409000，China）

In order to evaluate the safety of microecological fermentation bed for pigs breeding，this experiment chose the padding samples from the surface，middle and deep parts of the fermentation bed in a pig farm，isolated and identificated the samples,Escherichia coli.Then，the pathogenic experiment was carried out on the mice.The results showed that 6 strains of pathogenic E.coli were successfully isolated from the padding samples，so we thought that microecological fermentation bed for pigs breeding had some hidden dangers.

Fermentation bed；Pigs breeding；Safety evaluation

S815.2

B

1001-8964（2017）12-0035-02

2017-08-20

郭定章（1976-），男（土家族），重庆黔江人，大学本科，执业兽医师，现从事动物疫病防控和畜牧兽医技术推广工作。