肾康注射液中大黄素和大黄酚的含量测定方法研究

郑宏亮

摘 要：目的：建立HPLC法测定肾康注射液中大黄素和大黄酚的含量方法。方法：菲罗门C18柱（250×4.6mm，5？滋m）；甲醇-0.1%磷酸溶液（82：18）为流动相；柱温35℃；流速1.0ml·min-1；检测波长254nm；进样量：10μl。理论板数按大黄素峰计算应不低于3000。结果：大黄素在7.27μg·mL-1～145.30μg·mL-1浓度范围内具有良好的线性关系，R=0.99996，大黄素平均回收率为99.07%，RSD（%）=0.52%；大黄酚在4.86μg·mL-1～97.10μg·mL-1浓度范围内具有良好的线性关系，R=0.99998，大黄酚平均回收率为98.98%，RSD（%）=0.54%。结论：该方法准确、灵敏，可用于肾康注射液大黄素和大黄酚含量测定。

关键词：肾康注射液；大黄素、大黄酚；HPLC

肾康注射液由大黄、丹参、红花、黄芪四味药材提取加工而成的中药注射剂，主要是降逆泄浊、益气活血、通腑利湿，适用于慢性肾功能衰竭属湿浊血瘀证，症见恶心呕吐、口中粘腻、面色晦暗、身重困倦、腰疼、纳呆、腹胀、肌肤甲错、肢体麻木、舌质紫暗或有瘀点、舌苔厚腻、脉涩或细涩。为了严格控制本品质量，我们对主要成分大黄进行控制，大黄的有效成分中大黄素和大黄酚含量最高，参照药典和结合本品特点，建立了HPLC法测定本品中大黄素和大黄酚的含量测定方法，并对建立的方法进行了方法学验证试验，具体如下：

1 试药及来源

大黄素对照品（中检所，批号：110756-200110），大黄酚对照品（中检所，批号：110796-201017）；肾康注射液（市售样品，规格：20ml/支）；甲醇为色谱纯，磷酸为优级纯，水为重蒸水，其它试剂为分析纯。

2 仪器及色谱条件

高效液相色谱仪（岛津20A）；菲罗门C18柱（250×4.6mm，5？滋m）；甲醇-0.1%磷酸溶液（82：18）为流动相；柱温35℃；流速1.0ml·min-1；检测波长254nm；进样量：10μl。理论板数按大黄素峰计算应不低于3000。

3 对照品溶液、供试品溶液的制备

3.1 对照品溶液的制备：分别精密称取大黄素、大黄酚对照品各适量，分别用甲醇溶解并稀释制成每1ml含72μg大黄素、每1ml含48μg大黄酚的溶液。

3.2 供试品溶液的制备：精密量取本品2ml，置圆底烧瓶中，加水3ml，加8%的鹽酸溶液10ml，再加三氯甲烷10ml，加热回流30分钟，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取2次，每次10ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

4 线性关系考察

分别精密称取大黄素对照品14.53mg、大黄酚对照品9.71mg，分别置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。分别精密量取上述对照品贮备液各0.5、2.0、5.0、8.0ml，分别置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得不同浓度的对照品溶液，分别精密吸取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，分别对大黄素、大黄酚进行线性回归，结果见表1、2。

结果表明，大黄素在7.27μg·mL-1～145.30μg·mL-1浓度范围内线性关系良好；大黄酚在4.86μg·mL-1～97.10μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

5 精密度试验

取线性试验关系考察项下大黄素浓度为72.65μg·mL-1和大黄酚浓度为48.55μg·mL-1的对照品溶液，分别精密吸取10μl，连续进样6次，记录色谱峰面积，结果连续进样6次的峰面积相对标准偏差分别为0.18%、0.22%，仪器精密度良好。

6 重复性试验

取同一批次样品，按供试品溶液制备方法配制6份相同浓度的供试品溶液，照上述色谱条件，精密吸取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算大黄素、大黄酚的含量，结果见表3。

结果表明，重复性试验相对标准偏差小于2.0%，本方法测定大黄素和大黄酚含量的重复性良好。

7 回收率试验

分别精密称取大黄素对照品9.21mg、大黄酚对照品6.29mg，分别置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取本品1ml，共9份，分别精密加入对照品贮备液0.8、1.0、1.2ml（分别相当于1ml本品含量的80%、100%、120%），每个浓度水平各3份，分别置圆底烧瓶中，加水8ml，加16%的盐酸溶液10ml，再加三氯甲烷20ml，加热回流30分钟，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取2次，每次20ml，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按上述色谱条件，分别精密吸取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算大黄素、大黄酚的回收率，结果见表4、5。

结果表明，不同浓度下的大黄素和大黄酚平均回收率均在98～102%之间，相对标准偏差小于2.0%，该方法准确度高。

8 结论

本方法测定肾康注射液中大黄素和大黄酚含量，准确、可靠、重复性好，可用于本品的质量控制。

9 讨论

本方法采用流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（82：18），大黄素、大黄酚色谱峰与相邻色谱峰分离度良好，峰形好，而本品采用药典中大黄药材方法的流动相，分离度达不到要求，不适合本品。加8%的盐酸溶液10ml的目的是用酸水解的方法提取出大黄素、大黄酚，效果明显。

参考文献

[1]中华人民共和国药典（一部）.化学工业出版社，2015：23-24.endprint