二仙补肾益精解毒方对弱精子症大鼠模型氧化应激损伤的保护机制研究

刘绍明，郭军，张岳阳，时建华，丁红阳，张修举，陈小均

(1.北京中医药大学第三附属医院泌尿外科，北京 100029；2.中国中医科学院西苑医院男科，北京 100091；3.中国中医科学院望京医院男科，北京 100102；4.北京中医药大学东方医院泌尿外科，北京 100078)

二仙补肾益精解毒方对弱精子症大鼠模型氧化应激损伤的保护机制研究

刘绍明1，郭军2*，张岳阳3，时建华1，丁红阳1，张修举2，陈小均4

(1.北京中医药大学第三附属医院泌尿外科，北京 100029；2.中国中医科学院西苑医院男科，北京 100091；3.中国中医科学院望京医院男科，北京 100102；4.北京中医药大学东方医院泌尿外科，北京 100078)

目的：证实二仙补肾益精解毒方提高弱精子症精子活动力的作用并探讨其可能的作用机制。方法：挑选72只弱精子症大鼠模型随机等分为：低、中、高剂量给药组，左卡尼汀对照组，模型对照组和正常对照组6组进行对照，4周后检测精子数量并计算精子活动力；对睾丸生精小管标本进行病理观察；测定MDA、SOD和GSH的含量。结果：低、中、高剂量给药组和左卡尼汀对照组B级精子百分率有改善的趋势；MDA含量均降低，SOD含量及GSH含量均增高；中剂量给药组及左卡尼汀对照组大鼠睾丸生精小管内可见大量各级生精细胞。结论：二仙补肾益精解毒方可以明显提高精子活动力，可以增加生殖细胞对ROS的抗性。

弱精子症；氧化应激；精子活动力

正常的授精过程需要精子有正常的结构和功能，正常的精子活动力是精子完成授精过程的基本要素。精子活动力低下必然影响受孕成功率和生育质量。因精子活动力下降导致的弱精子症(asthenospermia/asthenozoospermia)是不育症的常见疾病类型，其病因复杂，占男性不育症患者的19%～20%[1]。弱精子症属于中医“精清”“精寒”“精薄”“精冷”范畴，现代中医学家认为“肾虚为本，湿热、血瘀、气滞等为标”是弱精子症的基本病机。但从临床实践来看，不育症绝大多数可能没有任何临床症状，给辨证论治带来了诸多困难。因此临床上一般使用微观辨精与宏观辨证相结合以及体质辨证等辨证方法。即便如此，据统计[2]，临床上有57.6%的不育患者体质类型为平和质，即使体质辨证也无法进行。因此，目前大部分中医家根据中医脾肾相生和精血互化学说理论，认为脾肾两虚夹瘀是无症状性弱精子症的基本病理变化，脾肾不足为本，治当健脾益肾，即“扶正”，瘀滞不畅为标，宜活血祛瘀，即“祛邪”。二仙补肾益精解毒方为北京中医药大学第三附属医院泌尿外科经验处方，化裁于《景岳全书》所载赞育丹，一方面补肾益精，即“扶正”，另一方面清除精室毒浊、瘀血，即“祛邪”，共同作用以达到提高精子活力之目的。我们前期通过应用二仙补肾益精解毒方治疗弱精子症的临床疗效观察，得出二仙补肾益精解毒方治疗弱精子症确实具有较好的临床效果[3-4]。清除多余氧自由基、恢复机体“氧化和抗氧化动态平衡”的氧化应激学说，从而提高精子质量及活动力，与中医的“扶正祛邪”达到“阴平阳秘”状态的学术思想相契合。基于此探讨补肾益精活血中药(二仙补肾益精解毒方)提高弱精子症的精子活动力、减少其非正常凋亡，是我们进行本项目研究的理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级SD远交成熟雄性大鼠105只，体质量200～250 g，购于北京斯贝福实验动物科学技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006。均在北京中医药大学基础医学院实验动物中心常规饲养。大鼠饲养过程中，自由进食、饮水，每天换水，隔日更换笼中垫料。环境温度20～25℃，光照：白天12 h/日。常规喂养一周大鼠适应后进行造模实验。

1.1.2 实验药物

二仙补肾益精解毒方：采用中药配方颗粒(由北京康仁堂药业有限公司统一制备，药品检验报告书符合2015版《中华人民共和国药典》的规定)，熟地黄24 g，白术24 g，当归18 g，枸杞子18 g，仙茅12 g，巴戟天12 g，山萸肉12 g，淫羊藿12 g，蛇床子6 g，人参15 g，白花蛇舌草10 g，蒲公英10 g，茯苓15 g，萆薢10 g，车前子10 g，血余炭10 g。

左卡尼汀口服液：又称左旋肉毒碱，是临床验证有效的抗氧化剂，由东北制药集团沈阳第一制药有限公司生产，国药准字H19990372。

1.2 实验方法

1.2.1 SPF级成熟SD雄性大鼠弱精子症模型构建和评价

1.2.1.1 构建大鼠弱精子症模型

根据参考文献[5-7]方法，使用奥硝唑(ORN)法构建SPF级SD远交成熟雄性大鼠弱精子症模型。

取SPF级SD成熟雄性大鼠90只，体质量200～250 g。常规喂养一周，待大鼠适应环境后进行造模实验。其中随机抽取15只正常喂养，作为实验时的空白对照组，每日一次用生理盐水以18 mL/kg体质量的剂量灌胃。其余90只每日用ORN溶液灌胃，ORN溶液由0.5%梭甲基纤维素钠溶液按25 mg/mL浓度现用现配制。灌胃剂量通过预实验选定，选用100 mg/(kg·d)剂量连续灌胃20 d，每天1次。从实验开始当日起计算，每周为大鼠称质量1次，并观察记录每只大鼠的体形、毛发颜色、走路姿势、寻找食物及日常行为表现，同时记录实验对象的死亡率并分析死亡原因。

1.2.1.2 评价大鼠弱精子症模型

模型构建完成后进行随机验证，评价是否造模成功。

最后一次给药24 h后，分别在90只造模大鼠中随机抽取6只、在15只空白对照组大鼠中随机抽取1只，进行精子活动力检测、精液氧化应激状态评价及观察睾丸组织结构的改变，判断弱精子症模型是否成功。

1.2.2 实验过程

筛选出弱精子症动物模型，运用二仙补肾益精解毒方进行干预，4周后取材，检测各组大鼠模型相关实验指标。同时与空白对照组进行对照。

将成功筛选出的弱精子症模型大鼠，随机分为6组，①低剂量给药组、②中剂量给药组、③高剂量给药组、④左卡尼汀对照组和⑤模型对照组，每组12只进行药物干预，与⑥空白对照组12只大鼠对照(在之前的空白对照组内随机抽取12只)。测定大鼠体质量，计算给药量。按大鼠与人体表面积的比值计算，大鼠(200 g)给药剂量为10 mL/(kg·d)。以中剂量25 g/(kg·d)作为等效剂量,临床1人用量150 g生药/60(kg·d)，低剂量和高剂量分别为大鼠等效剂量的0.5倍和2倍，三组药物浓度分别相当于人体用量的5倍、10倍和20倍。左卡尼汀对照组予左卡尼汀口服液灌胃，模型对照组和空白对照组予生理盐水。每组每日用药1次，共4周。以生理盐水配制各组药物浓度，各剂量二仙补肾益精解毒方药以煮沸生理盐水浸泡30 min制成浓缩液。

低剂量给药组：予二仙补肾益精解毒方浓缩液，按12.5 g生药/kg体质量的剂量进行灌胃。中剂量给药组：予二仙补肾益精解毒方浓缩液，按25 g生药/kg体质量的剂量进行灌胃。高剂量给药组：予二仙补肾益精解毒方浓缩液，按5 0g生药/kg体质量的剂量进行灌胃。左卡尼汀对照组：予左卡尼汀口服液0.1 g/kg体质量的剂量进行灌胃[8]。模型对照组：予生理盐水10 mL/kg体质量的剂量进行灌胃。空白对照组：予生理盐水10 mL/kg体质量的剂量进行灌胃。

给药4周后取材，进行相关指标检测。

1.3 统计学分析

对计量资料进行正态分析。如符合或近似符合正态分布，多个样本均数比较用方差分析，多重比较用LSD检验。不符合正态分布者，采用非参数检验的秩和检验，相关分析采用Spearman秩相关。统计分析采用SPSS 20.0统计软件。

2 实验结果

2.1 实验动物一般情况

造模过程中，除正常对照组外，所有大鼠从造模开始后很快出现体重减轻、食欲下降、活动减少、精神萎靡、体毛稀疏，光泽度降低、小便量增多、大便溏泄的症状，与中医药理论所说的“肾虚”证候表现相似。药物干预期间，空白对照组由于没有药物干预，灌胃的前9天内，体质量和活动量无明显增加，精神状态差，有大便溏泻的情况出现。模型对照组大鼠体质量和活动量均不如其他各组，毛发光泽度不高，总体情况较其他组差。二仙补肾益精解毒方高、中、低剂量组，左卡尼汀对照组实验大鼠在药物干预期间，从灌胃操作第8天开始，体质量和食量增加，体毛光泽度提高，活动量增加，出现打斗现象，小便量减少，大便良好。

整个造模和实验过程均没有大鼠死亡。

2.2 精液常规检查结果

动物造模后，除正常对照组外所有实验大鼠的B级精子百分率、前向精子(PR)百分率均出现明显减少，与正常组相比有明显差异，具有统计学意义(P<0.05)，表明造模成功。

2.3 精液氧化应激状态评价

2.3.1 MDA检测值

结果分析：与对照组比较，模型组及药物组MDA含量高，有统计意义(P<0.01)；与模型组比较，西药及中药各组MDA含量均降低，有统计意义(P<0.01)；中药中剂量组较高、低剂量组偏低，但无统计意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠精液MDA含量比较

注：与空白对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01

2.3.2 SOD检测值

结果分析显示：与对照组比较，模型组及药物组SOD含量均低，有统计意义(P<0.01)；与模型组比较，西药及中药各组SOD含量均增高，有统计意义(P<0.01)；中药中剂量组较高、低剂量组有增加趋势，但无统计意义(P>0.05)，见表2。

表2 各组大鼠精液SOD含量比较

注：与空白对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01

2.3.3 GSH检测值

二仙补肾益精解毒方作用后结果发现：与对照组比较，模型组及药物组GSH含量均低，有统计意义(P<0.01)；与模型组比较，西药及中药各组GSH含量均增高，有统计意义(P<0.01)；中药中剂量组较高、低剂量组有增加趋势，但无统计意义(P>0.05)，见表3。

2.4 各组大鼠睾丸病理学观察

左卡尼汀对照组及二仙补肾益精解毒方中剂量组睾丸及附睾均未见明显改变，睾丸生精小管内可见大量各级生精细胞，与正常对照组类似。详见图1～6。

表3 各组大鼠精液GSH含量比较

注：与空白对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01

图1 正常组睾丸组织(HE染色)

图2 正常组附睾组织(HE染色)

图3 左卡尼汀对照组睾丸组织(HE染色)

图4 左卡尼汀对照组附睾组织(HE染色)

图5 中剂量给药组睾丸组织(HE染色)

图6 中剂量给药组附睾组织(HE染色)

3 讨论

精液中缺少有活性的精子是导致男性生育能力降低的主要原因，通过有效清除生殖细胞内的ROS，优化精子质量、增加有活力精子的数量，是治疗弱精子症的核心环节，也是目前临床研究的重点。如何清除过量ROS、保护线粒体功能，对于保护精子活力、增加精子数量至关重要。

本实验选择检测SOD和GSH来判断二仙补肾益精解毒方抗氧化的能力。非酶促抗氧化剂也能显著降低MDA浓度，主要包括各种维生素、辅酶Q10以及左旋肉碱等。酶促和非酶促是机体内源性抗氧化剂，来自大自然的外源性抗氧化剂也不少，比如深海鱼、藻类等等。很多中草药及中药复方也被证明有很好的抗氧化作用。二仙补肾益精解毒方即是被实验证实的有效的外源性抗氧化剂。二仙补肾益精解毒方为北京中医药大学第三附属医院泌尿外科经验处方，化裁于《景岳全书》所载赞育丹，一方面补肾益精，即“扶正”，另一方面清除精室毒浊、瘀血，即“祛邪”，共同作用以达到提高精子活力之目的。通观全方，淫羊藿辛、甘，温，归肝、肾经，益肾助阳，现代中药药理也证明，淫羊藿能改善男性睾丸间质细胞功能，增加机体睾酮的血清水平；熟地黄甘温质润入肾，善滋阴补血，益精填髓，二药合用补肾温阳，益精填髓，共为君药，主导补肾益精以正“肾主生殖”的功效；仙茅、巴戟天鼓动肾气，补肾阳，增强淫羊藿益肾助阳的功效；山萸肉、枸杞子益精血，滋肾阴，增加熟地黄益肾填精的作用；人参、白术、茯苓补益脾气，更能补后天而益先天，正所谓以后天之精养先天之精，共为臣药，达到补肾益精健脾的功效；同时佐以车前子清热利湿，萆薢利膀胱水道、赤白便浊；蒲公英、白花蛇舌草清热解毒、利湿；当归补血活血；血余炭祛瘀血；蛇床子除能温肾壮阳增加君臣药力之外，还能燥湿杀虫，共同达到清热利湿活血解毒的作用。

本实验结果显示，二仙补肾益精解毒方在三个方面具有较好作用。一是在抗氧化方面能够提升抗氧化酶GSH、SOD的含量，同时降低MDA的含量。二是能改善精子活动力，提升A级精子百分率。与正常对照组比较，各组A级精子活动力均偏低；与模型组比较，左卡尼汀对照组和中剂量给药组活动力明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，其他各组有改善的趋势，但差异无统计学意义。三是对睾丸病理结构有改善作用。显微镜观察HE染色各组睾丸病理组织切片，与正常对照组比较，模型对照组大鼠睾丸的生精小管管腔内可见大量各级生精细胞脱落，而中剂量给药组及左卡尼汀对照组大鼠睾丸均未见明显改变，睾丸生精小管内可见大量各级生精细胞，均与正常对照组类似。以上数据显示，二仙补肾益精解毒方能提高模型大鼠的精子活动力，提高抗氧化酶SOD、GSH含量，进而清除精液ROS，同时能保护睾丸生精小管，促使各级生精细胞产生、生长及成熟，值得进一步研究开发。

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ProtectiveMechanismofErxianBushenYijingJieduFormulaforAsthenospermiaRatswithOxidativeStressInjury

LIU Shao-ming1,GUO Jun2,ZHANG Yue-yang3,SHI Jian-hua1,DING Hong-yang1,ZHANG Xiu-ju2,CHEN Xiao-jun4

(1.TheThirdAffiliatedHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 2.XiyuanHospital,ChineseAcademyofChineseMedicineScience,Beijing100091,China; 3.WangjingHospital,ChineseAcademyofChineseMedicineScience,Beijing100102,China; 4.DongfangHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100078,China)

Objective: To observe the protective effect of Erxian Bushen Yijing Jiedu formula improving sperm motility in asthenospermia rats with oxidative stress injury induced by Ornidazole, and to explore its possible mechanism. Methods: 72 rats were randomly divided into the blank control group, the model group, the Levocarnitine group, and low-dose medication group, middle-dose medication group, and high-dose medication group, the medication groups were treated with Erxian Bushen Yijing Jiedu formula. After four-week treatment, sperm count and sperm motility were evaluated, pathological changes were observed in seminiferous tubules of testicles, and contents of MDA, SOD and GSH-Px in testicles and epididymal tissues were determinated by spectrophotometry. Results: Grade B sperm productivity showed an improved tendency in the three medication groups and in the Levocarnitine group compared to the model group; the content of MDA was decreased, and in the contents of SOD and GSH were increased significantly in the three medication groups and in the Levocarnitine group compared to the model group; Pathological studies showed that a large number of spermatogenic cells were found in the seminiferous tubules in the middle-dose medication group and the Levocarnitine group, which were similar to those in the blank control group. Conclusion: Erxian Bushen Yijing Jiedu formula can improve sperm motility and the resistance of generative cells to ROS.

Asthenospermia; Oxidative stress; Sperm motility

R285.5;R698+.2

A

1002-2392(2017)06-0032-05

2017-08-25

2017-11-20

国家自然科学基金面上项目(81473527)

刘绍明(1975-)，男，硕士，副主任医师，硕士生导师，主要从事泌尿男科专业工作。

*通讯作者：郭军(1965-)，男，硕士，主任医师，博士生导师，主要从事泌尿男科专业工作。