5个大豆AT-hook基因GmAHLs的克隆与定位分析

张大勇， 戚维聪， 万 群， 刘 佳， 徐照龙， 黄益洪， 邵宏波>

(江苏省农业科学院 农业资源与环境研究所 盐土农业研究中心， 江苏 南京 210014)

5个大豆AT-hook基因GmAHLs的克隆与定位分析

张大勇①， 戚维聪①， 万 群， 刘 佳， 徐照龙， 黄益洪， 邵宏波②>

(江苏省农业科学院 农业资源与环境研究所 盐土农业研究中心， 江苏 南京 210014)

从大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕中克隆出5个AT-hook基因，分别命名为GmAHL1、GmAHL2、GmAHL3、GmAHL4和GmAHL5，其中，GmAHL5为GmAHL1的重复基因。序列分析结果表明：5个GmAHLs蛋白的AT-hook基序分别位于其氨基酸序列的42～54、39～51、42～54、41～53及42～54处，且GmAHL1和GmAHL5蛋白的氨基酸序列相同。大豆GmAHLs蛋白和野大豆(G.sojaSieb. et Zucc.) GsAHLs蛋白与其他植物H1组蛋白的亲缘关系较远，说明GmAHLs蛋白不属于H1组蛋白。GmAHL1基因在所有检测的组织中均不表达；GmAHL2基因主要在花、种子、叶片和根中表达；GmAHL3基因主要在花、叶片、茎和根尖分生组织中表达，在果荚中不表达，但在根瘤中有表达；GmAHL4基因在根瘤中高度表达，在根、茎端分生组织、茎和果荚中也有较高表达；GmAHL5基因主要在叶片、种子、根尖分生组织和花中表达。GmAHL2基因在根中的表达受氨的诱导，GmAHL3基因在根中的表达受硝酸盐、尿素和根瘤菌的抑制。亚细胞定位分析结果表明：大豆GmAHLs蛋白定位于细胞核。研究结果显示：大豆GmAHLs基因均非组成型表达基因，其中GmAHL2、GmAHL3和GmAHL4基因的表达具有特异性，且可被外源氮素和根瘤菌处理诱导或抑制。

大豆； AT-hook基因；GmAHLs； 克隆； 表达； 亚细胞定位

AT-hook蛋白是一类DNA结合蛋白，含有以精氨酸(Arg)-甘氨酸(Gly)-精氨酸(Arg)-脯氨酸(Pro)(RGRP)为核心的小基序，因此AT-hook基序也被称作RGRP基序[1]。AT-hook蛋白首先是在哺乳动物非组蛋白的染色体高移动群蛋白HMG-1/Y中被发现[2]，这类蛋白往往定位于细胞核，又被称为AHL蛋白(AT-hook motif nuclear localized protein)[3]。目前，在拟南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕、水稻(OryzasativaLinn.)、番茄(SolanumlycopersicumLinn.)、大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕和小麦(TriticumaestivumLinn.)等植物中也发现有AT-hook蛋白[4]，而且越来越多的AT-hook基因家族成员被鉴定出来，如拟南芥[3]、水稻[5]和番茄[6]中分别含有29、45和32个成员。

AT-hook蛋白家族不仅在植物生长发育、器官构建、逆境胁迫和激素信号应答中起重要作用，还可作为染色体结构和转录因子的辅助因子，调节基因的转录活性[7-8]。AHL27基因过量表达可降低叶片衰老基因的表达水平，提高叶片光合效率和叶绿素含量以延缓植物叶片的衰老[9]；而过量表达拟南芥AHL27基因可推迟拟南芥开花[10-11]。说明AHL27蛋白在植物的营养生长过程中起重要作用，能够延缓营养生长向生殖生长的转化。丁丽雪等[6]采用脱落酸、水杨酸、NaCl、高温和低温处理番茄幼苗，结果显示：32个AT-hook基因受诱导表达，其中部分基因显著上调或下调表达，推测这些基因很可能参与了番茄逆境胁迫条件下的防御应答反应。大豆含有AT-hook基序的GmHMG-I蛋白可以与大豆根瘤素基因N23和质体蓝素基因的启动子相互作用[12-13]；也有研究认为，大豆的HMG-A相似蛋白AT-1SNBP能够结合到大豆谷氨酞胺合成酶基因GSI5的启动子上，作为结构蛋白维持该启动子的空间构象[14]。

作者前期从大豆酵母双杂交文库中筛选到1个HMGB1基因，该基因编码的氨基酸序列中含有AT-hook基序。本研究从大豆中分离出5个AT-hook基因，分析其基因序列、蛋白质结构及基因的数字表达，并与野大豆(GlycinesojaSieb. et Zucc.)进行了序列比较，还通过烟草(NicotianatabacumLinn.)表皮细胞进行了亚细胞定位，以系统研究大豆AT-hook基因及其编码蛋白。

1 材料和方法

1.1 材料

所用大豆品系Willasm82、大肠杆菌DH5α、农杆菌GV3101、过表达载体pMDC83均由江苏省农业科学院盐土农业研究中心保存。载体pGEM-T购自Promega公司，载体构建所用的KOD DNA聚合酶、质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒分别购自宝生物工程(大连)有限公司和天根生化科技(北京)有限公司。实验用引物合成和序列测定由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 基因克隆

PCR体系含cDNA 2.0 μL、10×PCR缓冲液5.0 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 4.0 μL、2 mmol·L-1MgSO43.0 μL，10 μmol·L-1上游和下游引物各1.5 μL、KOD DNA聚合酶1.0 μL，ddH2O补足至50.0 μL。扩增程序为：98 ℃ 预变性3 min；98 ℃变性5 s、55 ℃退火10 s、68 ℃延伸1 min，35个循环；暂停程序，加入1.0 μL KOD DNA聚合酶，68 ℃延伸10 min。电泳检测后将PCR产物送交南京金斯瑞生物科技有限公司测序，获得目的基因序列，所用引物见表1。

1.3 序列信息分析

利用www.soybase.org网站提供的数据库分析核实基因序列，利用www.ncbi.nlm.nih.gov网站的BLASTp程序分析目的蛋白的结构域和预测保守氨基酸，利用Vector NTI软件(美国Invitrogen公司)进行多重比对和系统进化树的构建。

1.4 基因数字表达分析

从公共数据库(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/；https：∥www.soybase.org/；https：∥phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Gmax)下载共享的大豆不同组织的转录组测序原始数据(clean reads)。使用已得到的大豆基因GmAHL1、GmAHL2、GmAHL3、GmAHL4和GmAHL5为参考序列，使用短reads比对软件SOAP2/SOAPaligner将clean reads比对到参考序列上，并利用RPKM法[15]计算基因在不同组织中的表达量。

表1大豆GmAHLs基因PCR扩增的引物序列

Table1PrimersequencesusedforPCRamplificationofGmAHLsgenesfromGlycinemax(Linn.)Merr.

引物 Primer正向引物序列(5'→3') Sequenceofforwardprimer(5'→3')反向引物序列(5'→3') Sequenceofreverseprimer(5'→3')P1CACCATGATGGGCAAGAAGAAGCCACTGCTCTTTCTGGGTTTGCTTTTCP2CACCATGATGGGTAAGAAGAAGCCACTACTCTTTCTGGGTTTGCTTTTCP3CACCATGGGGAAAAAGAAGCGCCAAGTGCTTTTTCTGGGTTTGCTTTP4CACCATGGGGAAAAAGAATCGCCAAGTGCTTTTTCTGGGTTTGCTTT

1.5 亚细胞定位分析

设计5′端添加CACC的正向引物和3′端去除终止密码子的反向引物(表1)，利用pENTRTM/D-TOPO vector将GmAHL1、GmAHL2、GmAHL3和GmAHL4基因置换到中间载体上，利用Gateway LR ClonaseTM试剂盒将目的基因置换到植物表达载体pMDC83上，构建pMDC83-GmAHLs-GFP，然后测序验证。利用冻融法[16]将pMDC83-GmAHLs-GFP转化农杆菌GV3101，然后注射烟草表皮，参照李晓君等[17]的方法，25 ℃培养24 h，采用ZEISS LSM510 Meta激光共聚焦显微镜(德国ZEISS公司)观察GFP信号，确定GmAHLs蛋白的亚细胞定位，同时用DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)进行细胞核荧光染色。

2 结果和分析

2.1 GmAHLs基因的克隆与序列分析

从公共数据库https：∥phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Gmax网站找到大豆中5个含有AT-hook基序的基因，登陆号分别为Glyma14g074800、Glyma04g032400、Glyma06g032300、Glyma14g075100和Glyma17g250300，依次命名为GmAHL1、GmAHL2、GmAHL3、GmAHL4和GmAHL5，其中，GmAHL5为GmAHL1的重复基因。序列分析结果显示：GmAHL1基因包含3个内含子和4个外显子，其余4个基因均无内含子。

对大豆GmAHLs蛋白与野大豆GsAHLs蛋白的氨基酸序列进行多重比对， 结果见图1。大豆GmAHL1、GmAHL2、GmAHL3、GmAHL4和GmAHL5蛋白的AT-hook基序分别位于其氨基酸序列的42～54、39～51、42～54、41～53及42～54处，且GmAHL1和GmAHL5蛋白的氨基酸序列完全一致。对大豆GmAHL蛋白与野大豆GsAHL蛋白的氨基酸序列进行比较，在C端GsAHL1蛋白的氨基酸序列较GmAHL1蛋白少了1个氨基酸S，GmAHL2蛋白与GsAHL2蛋白，以及GmAHL4蛋白与GsAHL4蛋白的氨基酸序列完全一致，GmAHL3蛋白与GsAHL3蛋白的氨基酸序列有3个氨基酸存在差异；GmAHL5蛋白与GsAHL5蛋白的氨基酸序列差异较大，且GsAHL5蛋白氨基酸序列的RGRP基序缺少1个P。

GmAHL1，GmAHL2，GmAHL3，GmAHL4，GmAHL5： 大豆Glycine max (Linn.) Merr.； GsAHL1，GsAHL2，GsAHL3，GsAHL4，GsAHL5： 野大豆G. soja Sieb. et Zucc.图1 大豆GmAHLs蛋白与野大豆GsAHLs蛋白的氨基酸序列的多重比对结果Fig. 1 Result of multiple alignment of amino acid sequences of GmAHLs proteins from Glycine max (Linn.) Merr. and GsAHLs proteins from G. soja Sieb. et Zucc.

将大豆GmAHLs蛋白与含有AT-hook基序的其他植物的H1组蛋白进行系统树进化分析，结果见图2。大豆GmAHLs蛋白和野大豆GsAHLs蛋白与其他植物H1组蛋白的亲缘关系较远，表明尽管大豆GmAHLs蛋白均为AT-hook蛋白，但不属于H1组蛋白。

2.2 GmAHLs基因的数字表达分析

大豆GmAHLs基因在不同组织中的数字表达结果见图3。由图3可见：GmAHL1基因在所有检测的大豆组织中均不表达；GmAHL2基因主要在花、种子、叶片和根中表达，其在根中的表达受氨的诱导；GmAHL3基因主要在花、叶片、茎和根尖分生组织中表达，在种子中表达量较低，在果荚中不表达，其根部的表达受硝酸盐、尿素和根瘤菌的抑制，但在根瘤中有表达；GmAHL4基因在根瘤中高度表达，根、茎端分生组织、茎和果荚中也有较高表达；GmAHL5基因主要在叶片、种子、根尖分生组织和花中表达。

分支上的数据表示bootstrap百分比Datums above the branches indicate percentage of bootstrap. GmAHL1，GmAHL2，GmAHL3，GmAHL4，GmAHL5： 大豆Glycine max (Linn.) Merr.； GsAHL1，GsAHL2，GsAHL3，GsAHL4，GsAHL5： 野大豆G. soja Sieb. et Zucc.； MmH1： Musa acuminata subsp. malaccensis (Ridl.) N. W. Simmonds； TaH1： 小麦Triticum aestivum Linn.； LlH1： 麝香百合Lilium longiflorum Thunb.； SbH1： 高粱Sorghum bicolor (Linn.) Moench； ZmH1： 玉米Zea mays Linn.； BdH1： 二穗短柄草Brachypodium distachyon (Linn.) P. Beauv.； OsH1： 水稻Oryza sativa Linn.； ObH1： Oryza brachyantha A. Chev. et Roehrich.图2 大豆GmAHLs蛋白与其他植物H1组蛋白的NJ系统树Fig. 2 NJ phylogenetic tree of GmAHLs proteins from Glycine max (Linn.) Merr. and H1 histones from other species

红色—黄色—绿色表示基因表达量从0到最大 Red-green-yellow means that the expression of gene increasing from zero to the maximum.图3 大豆GmAHLs基因在不同组织中的数字表达Fig. 3 Digital expression of GmAHLs genes from Glycine max (Linn.) Merr. in different tissues

2.3 GmAHLs蛋白的亚细胞定位分析

由于GmAHL1和GmAHL5蛋白具有完全相同的氨基酸序列，因此，用含有pMDC83-GmAHL1-GFP、pMDC83-GmAHL2-GFP、pMDC83-GmAHL3-GFP和pMDC83-GmAHL4-GFP的GV3101农杆菌注射烟草叶片表皮后，发现4个GmAHLs蛋白的GFP标记与经过DAPI染色的细胞核很好地融合在一起(图4)，表明这4个GmAHLs蛋白全部定位于细胞核。

DAPI： 4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(细胞核荧光染色) 4′，6-diamidino-2-phenylindole (cell nuclear fluorescent staining)； GFP： 绿色荧光蛋白Green fluorescent protein； B： 明场Bright； M： 融合Merge； GmAHL1-GFP，GmAHL2-GFP，GmAHL3-GFP，GmAHL4-GFP： 分别为GmAHL1、GmAHL2、GmAHL3和GmAHL4蛋白与GFP的融合蛋白Merged proteins of GmAHL1， GmAHL2， GmAHL3， and GmAHL4 proteins with GFP， respectively.图4 大豆GmAHLs蛋白在烟草叶片表皮细胞的亚细胞定位Fig. 4 Subcellular localization of GmAHLs proteins from Glycine max (Linn.) Merr. in epidermal cells of Nicotiana tabacum Linn. leaf

3 讨 论

目前，AHLs基因在所有测序完成的植物中普遍存在，从单细胞的苔藓到单子叶和双子叶植物，如拟南芥、水稻、高粱〔Sorghumbicolor(Linn.) Moench〕和杨树(Populusspp.)等[18]，这种在进化过程中的高度保守性表明AHL基因家族在植物的生长发育过程中起重要作用。根据AHL蛋白序列中保守核心氨基酸基序Arg(R)-Gly(G)-Arg(R)侧翼序列氨基酸的特征，尤其是C端序列，AHL蛋白可以分为2个类型：Ⅰ型的C端为Gly(G)-Ser(S)-Lys(K)-Asn(N)-Lys(K)；Ⅱ型的C端为Arg(R)-Lys(K)-Tyr(Y)-X(任意氨基酸)[4]。Aravind等[19]则将AHL蛋白分为3类：Ⅰ型AHL蛋白的RGRP基序下游第2位置为Gly(G)；Ⅱ型AHL蛋白的RGRP基序下游第2位置为Lys(K)；Ⅲ型AHL蛋白的RGRP基序下游第4位置为Lys(K)。本研究克隆的大豆GmAHLs基因编码的氨基酸序列仅含有1个保守的RGRP基序，且RGRP下游第2位氨基酸均为K，属于Ⅱ型AHL蛋白。与Musaacuminatasubsp.malaccensis(Ridl.) N. W. Simmonds、小麦、麝香百合(LiliumlongiflorumThunb.)、高粱、玉米(ZeamaysLinn.)、二穗短柄草〔Brachypodiumdistachyon(Linn.) P. Beauv.〕、水稻和OryzabrachyanthaA. Chev. et Roehrich H1组蛋白的聚类分析结果显示：大豆GmAHLs蛋白与上述植物H1组蛋白分为2类，表明大豆GmAHLs蛋白不属于H1组蛋白，推测可能属于非组蛋白类型，用于结合DNA与组蛋白共同构成核染色质，进而组装成染色体。

丁丽雪等[6]利用实时荧光定量PCR技术对番茄32个植株的AT-hook基因进行组织表达分析，认为该类基因在根和花中表达较高；拟南芥AHL22基因过表达表现出开花延迟和胚轴伸长受抑制表型[20]；而Jin等[21]认为，AT-hook蛋白对于水稻的内稃形成和花器官发育是必需的，且AT-hook蛋白对植物花的发育存在较大影响。作者对数据库中现有表达数据的分析认为，大豆AT-hook基因(GmAHL1除外)在各组织中均有不同程度的表达，并且在根部表达受外界生物和非生物胁迫的诱导。

AHL蛋白含有4个保守的RGRP残基[2]，这个短的保守氨基酸序列对AHL蛋白结合DNA和细胞核定位是必需的[19，22]。本研究获得的4个大豆GmAHLs蛋白均含有保守的RGRP基序，这对其定位于细胞核起到重要作用。Fujimoto等[3]研究结果表明：陆生植物的AHL蛋白在C端含有PPC结构域，通常含有LRS、GRFEIL和FTPH 3类基序之一，PPC结构域负责AHL蛋白的核定位和与其他蛋白相互作用，大豆GmAHLs蛋白在C端没有类似的PPC基序，而本研究通过烟草注射的方法发现大豆的GmAHLs蛋白全部定位于细胞核，暗示RGRP基序可能对GmAHLs蛋白的亚细胞定位起着至关重要的作用，然而，对于该类基因在大豆植株生长发育和应答外界胁迫的功能和机制仍然需要进一步研究。

本研究首次报道并克隆了大豆中编码AT-hook蛋白的GmAHLs基因，并对这些基因在大豆不同组织的表达以及GmAHLs蛋白的亚细胞定位进行系统研究，为今后该类基因在大豆中的研究奠定了基础。

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CloningandlocalizationanalysisonfiveAT-hookgenesGmAHLsfromGlycinemax

ZHANG Dayong①， QI Weicong①， WAN Qun， LIU Jia， XU Zhaolong， HUANG Yihong， SHAO Hongbo②

(Salt-soil Agricultural Center， Institute of Agricultural Resources and Environment， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China)，J.PlantResour. &Environ.， 2017，26(4)： 1-7

Five AT-hook genes were cloned fromGlycinemax(Linn.) Merr.， which were named asGmAHL1，GmAHL2，GmAHL3，GmAHL4， andGmAHL5， respectively， in which，GmAHL5 is duplicated gene ofGmAHL1. The sequence analysis result shows that AT-hook motifs of five GmAHLs proteins are located in their amino acid sequences of 42-54， 39-51， 42-54， 41-53， and 42-54， respectively， and GmAHL1 and GmAHL5 proteins share the same amino acid sequence. There is a distant relationship between GmAHLs proteins fromG.maxand GsAHLs proteins fromG.sojaSieb. et Zucc. with H1 histones from other species， meaning that GmAHLs proteins do not belong to H1 histones.GmAHL1 gene doesn’t express in all tissues tested；GmAHL2 gene mainly expresses in flower， seed， leaf， and root；GmAHL3 gene mainly expresses in flower， leaf， stem， and root tip meristem， does not in pod， but does in root nodule；GmAHL4 gene highly expresses in root nodule， and also relatively highly does in root， shoot apical meristem， stem， and pod；GmAHL5 gene mainly expresses in leaf， seed， root tip meristem， and flower. Expression ofGmAHL2 gene in root is induced by ammonia， while that ofGmAHL3 gene in root is inhibited by nitrate， urea， and rhizobia. The subcellular location analysis result shows that GmAHLs proteins fromG.maxare located in cell nucleus. It is suggested thatGmAHLsgenes fromG.maxare nonconstitutive expression genes， in which， expressions ofGmAHL2，GmAHL3， andGmAHL4 genes have specificity and can be induced or suppressed by exogenous nitrogen and rhizobia.

Glycinemax(Linn.) Merr.； AT-hook gene；GmAHLs； cloning； expression； subcellular location

Q943.2； S565.1

A

1674-7895(2017)04-0001-07

10.3969/j.issn.1674-7895.2017.04.01

2017-08-03

国家自然科学基金资助项目(31600211)； 江苏省农业三新工程项目〔SXGC(2016)335〕； 江苏省农业科技自主创新资金项目〔CX(15)1005〕

张大勇(1979—)，男，山西汾阳人，博士，副研究员，主要从事大豆耐盐分子生物学方面的研究。戚维聪(1981—)，男，河北承德人，博士，助理研究员，主要从事植物抗逆方面的研究。

①共同第一作者

②通信作者E-mail： shaohongbochu@126.com

张明霞)