基于SRAP分子标记的广宁红花油茶种质资源遗传多样性研究

谢 荟，祝文娟，张应中，蒋开彬，刘天颐，莫其辉，黄少伟

（1.华南农业大学 林学与风景园林学院，广东 广州 510642；2.广东省林业科学研究院，广东 广州510520；3.广宁县林业科学研究所，广东 广宁 526300）

基于SRAP分子标记的广宁红花油茶种质资源遗传多样性研究

谢 荟1，祝文娟1，张应中2，蒋开彬1，刘天颐1，莫其辉3，黄少伟1

（1.华南农业大学 林学与风景园林学院，广东 广州 510642；2.广东省林业科学研究院，广东 广州510520；3.广宁县林业科学研究所，广东 广宁 526300）

利用SRAP分子标记建立广东省4个种群153个单株的广宁红花油茶种质资源遗传多样性评价体系，从594对引物组合中最终选出13对引物，结果表明：13对引物组合共扩增出206条带，平均每对引物组合获得15.85条，多态性条带为187条，多态性条带比率(PPB)为90.78%。种群Nei’s 基因多样度(h)、Shannon多样性指数(I)、多态性位点百分比 (PPL)变化范围分别为0.217 9～0.356 3，0.321 7～0.524 8及58.25%～92.72%，平均值分别为0.307 8，0.456 3及83.62%，表明广宁红花油茶具有丰富的遗传多样性。聚类分析表明，当阈值为0.93时，可将广宁红花油茶4个种群分为2大类，广东清远单独成为一类，第二类包括广东广宁县，广东增城，广东云浮。广东云浮与广东增城遗传距离为0.019 3，遗传距离最小，说明二者的亲缘关系最近。AMOVA分子变异方差分析显示，在广宁红花油茶总的遗传变异中，种群内占95%，而种群间仅占5%。

广宁红花油茶；种质资源；SRAP分子标记；遗传多样性

油茶Camellia oleifera是我国特有的木本食用油料树种，其营养价值十分丰富，不饱和脂肪酸含量很高，是世界四大木本食用油料树种之一[1-2]。广宁红花油茶Camellia semiserrata又名南山茶，华南红花油茶，为山茶科Theaceae山茶属Camellia植物，是油茶其中的一个种，常绿乔木，因其模式标本采自广东广宁县，故名广宁红花油茶[3]。广宁红花油茶主要分布在广西东南部和广东西南部，是优良的乡土阔叶树种之一[4]。近年来关于广宁红花油茶的研究大多集中在种子成分、果实形状、扦插技术、树体性状、组织培养及生理生化等方面的研究[5-8]。作为重要的木本油料树种，通过分子水平的研究，可为广宁红花油茶优质种源收集、良种选育及种质资源保护奠定基础。

在分子生物学上，常用的DNA分子标记有 RFLP、RAPD、AFLP 和 SSR 等方法，它们各有优缺点[9]。相关序列扩增多态性（sequence related ampli fied polymorphism，SRAP）是由Li和Quiros[10]开发出来的一种新型DNA分子标记，具有重复性好，引物通用性强，易于目标片段测序等优点，在遗传多样性分析、分子鉴定及指纹图谱分析等领域被广泛应用[11]。

遗传多样性是研究物种多样化的前提和基础，深入研究遗传多样性为林木遗传育种奠定基础[12]。本研究利用SRAP 分子标记对不同种群的广宁红花油茶进行DNA多态性分析，获得不同种群的遗传多样性，了解各种群的遗传变异程度及种群间的亲缘关系，为以后广宁红花油茶的种质资源开发、保存及选育提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

共收集广宁红花油茶4个种群共153个单株，均来自于广东省人工林，包括广宁县72株，增城市37株，清远市5株，云浮市39株。依据样地数量的多少确定单株数目，采集单株的叶片放于液氮中，之后放在-80 ℃冰箱中长期保存。

1.2 方 法

1.2.1 DNA的提取

取广宁红花油茶的叶片100 mg，采用新型植物组织DNA提取试剂盒（北京天根公司）进行DNA提取，2%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA质量，用核酸检测仪（Thermo SCIENTIFIC NanoDrop 1 000）进行DNA浓度检测，记录每个样品的DNA浓度及每个样品的260/280值，检测基因组DNA的质量，-20 ℃冰箱中贮藏备用。

1.2.2 SRAP-PCR扩增体系及程序

本研究中SRAP分子标记上游引物为22个，命名为Me1-Me22，下游引物为27个，命名为Em1-Em27，均由上海生工生物技术公司合成。通过单因素和正交设计相结合的方法得到稳定的SRAP-PCR扩增体系[13]，而PCR扩增反应在PTC-200和Biometra Tprofessional PCR扩增仪上进行，反应程序为：94 ℃ 变性5 min，94 ℃ 变性1 min，退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，退火温度为55 ℃，35个循环，72 ℃延伸10 min，反应体系总体积为25 µL（表1）。

表1 广宁红花油茶的SRAP扩增体系Table 1 SRAP amplification system of C. semiserrata

1.2.3 引物筛选

在594对SRAP引物组合中，对广宁红花油茶进行SRAP引物的初筛与复筛。

初筛时，随机选取来自不同种群的8个单株DNA作为模板DNA，PCR扩增结果在6%聚丙烯酰胺凝胶电泳上检测。筛选条带清晰及具有多态性的SRAP引物进行其引物复筛，最终得到清晰稳定及多态性较强的SRAP引物（表2），用于后续SRAP分子标记遗传多样性分析。

表2 SRAP扩增引物组合碱基序列（5’→3’）Table 2 The applied SRAP primer sequences(5’→3’)

1.2.4 SRAP-PCR 的数据处理

采用筛选出的引物组合对4个种群的153个单株DNA进行SRAP-PCR扩增。按照相同迁移位置上有扩增条带记为“1” 、无则记为“0”的方法记录每个引物的电泳谱带，且仅记录清晰、重复性好的扩增条带，并将“1” 、“0”数据转化成基因型矩阵。

利用 POPGENE version 1.32获得种群 Nei’s基因多样度(h)、Shannon多样性指数(I)、多态性位点百分比(PPL)[14]。根据遗传距离，利用NTSYS2.10软件进行聚类分析[15]。利用GenAlex6.4软件对广宁红花油茶4个种群进行AMOVA分子变异方差分析，计算方差组分，分析群体遗传分量[16]。

2 结果与分析

2.1 广宁红花油茶引物多态性分析

经过SRAP引物初筛和复筛，最终得到清晰且重复性高的引物组合13对，并利用这些引物对不同地区的广宁红花油茶153个单株进行扩增。如表3所示，13对引物共扩增出206条清晰且重复性高的条带，其中多态性条带共187条，多态性条带比率为90.78%；平均每对的扩增数为15.85条，平均每对扩增的多态性条带为14.38条；其中引物组合Me21Em9扩增的条带数最多，高达23条，而引物组合Me9Em24扩增的条带数最少，低至6条；多态性条带比率达到100%的引物组合为Me12Em7。图1为引物组合Me15Em19对部分样品的SRAP-PCR扩增结果。

表3 13 SRAP引物对广宁红花油茶153个单株检测的多样性Table 3 Polymorphism detected by thirteen pairs of SRAP primers in 153 individuals of C. semiserrata

图1 引物为Me15Em19 的部分广宁红花油茶种群检测Fig.1 Detection for part of the C. semiserrata populations by primers Me15 Em19

2.2 广宁红花油茶遗传多样性分析

对广宁红花油茶不同种群的遗传参数进行统计分析表明（表4），广宁红花油茶种群间的遗传多样性水平存在差异，4个种群的多态性位点百分比（PPL）的变化范围为58.25%～92.72%，4个种群中最高的为广东增城，多态性位点百分比为92.72%，最低的为广东清远，多态性位点百分比仅为58.25%；等位基因数（Na）的变化范围为1.582 5～1.927 2，有效等位基因数（Ne）的变化范围为1.387 1～1.620 9，Nei’s 基因多样度（h）的变化范围为0.217 9～0.356 3，Shannon多样性指数的变化范围为0.321 7～0.524 8。以上遗传多样性参数均能够有效的反映种群的遗传多样性状况，综合各种群获得的参数水平，广东增城的广宁红花油茶遗传多样性最高，广东清远的遗传多样性相对较低。

2.3 广宁红花油茶种群遗传变异分析

对广宁红花油茶4个种群进行AMOVA分子变异方差分析（表5），广宁红花油茶种群内和种群间存在显著的遗传变异（p＜0.001），95 %的遗传变异存在于广宁红花油茶种群内，而仅仅5 %的遗传变异存在于种群间。由此结果表明，广宁红花油茶种群内遗传变异远远大于种群间遗传变异，即其遗传变异主要来源于种群内。

表4 广宁红花油茶种群遗传多样性指数†Table 4 Genetic diversity index in the C. semiserrata populations

2.4 广宁红花油茶种群间的遗传距离及聚类分析

对4个广宁红花油茶种群的遗传距离统计分析结果如表6所示，种群间的遗传距离在0.019 3～0.155 2，平均遗传距离为0.079 6；其中，广东广宁县和广东清远的遗传距离最大，为0.155 2，说明遗传差异最大，亲缘关系最远；而广东大南山和广东增城的遗传距离最小，为0.019 3，说明遗传差异最小，亲缘关系最近。

表5 广宁红花油茶种群内与种群间变异的AMOVA分析结果Table 5 AMOVA for the genetic variation within and among populations of C. semiserrata

表6 广宁红花油茶种群的Nei遗传距离和遗传一致度分析†Table 6 Nei’s Unbiased Measures of Genetic Identity and Genetic distance of C. semiserrata

对4个种群进行Nei无偏遗传距离分析，利用UPGM法进行聚类，构建广宁红花油茶4个种群的系统聚类图（图2）。当阈值为0.93时，4个广宁红花油茶种群分成两大类，广东清远单独成为一类，第二类包括广东广宁县、广东增城、广东云浮。

图2 基于SRAP的广宁红花油茶种源聚类分析结果Fig.2 SRAP based cluster of C. semiserrata populations

3 结论与讨论

由于广宁红花油茶有较高的经济价值，因此针对其进行遗传多样性分析尤为重要，了解其遗传差异及地理分布规律，建立遗传多样性评价体系，旨在为广宁红花油茶的良种选育奠定基础 。

种群的遗传多样性大小是物种长期进化的产物，遗传多样性越高，环境适应能力越强，就能使物种更好的生存下去[17]。SRAP标记对植物的遗传多样性分析大都集中在应用广泛的经济植物，而对其他植物种类的应用较少[18]。相关研究证明了SRAP能为亲本鉴定和亲缘关系分析等研究提供分子标记参考[19]。迄今在广宁红花油茶上针对生理学方面的研究较多，在分子标记方面的研究极少，SRAP分子标记未见报道。

从本研究广宁红花油茶的种群遗传多样性来看，广东广宁县、广东大南山和广东增城种群遗传多样性指数偏高，而广东清远和广东云浮种群遗传多样性指数相对较低，种群Nei’s 基因多样度(h)、Shannon多样性指数(I)、多态性条带比率(PPL)平均值分别为0.305 3，0.453 4及83.78%，高于同样运用SRAP标记的山茶科湖北油茶Camellia Oleifera[20]、茶树Camellia sinensis[21]，揭示了广宁红花油茶种群遗传多样性比较丰富。

同时，较高的遗传多样性也揭示广宁红花油茶资源存在较大程度的遗传变异，具备开展良种选育的基础，通过选择可获得较高的遗传增益。遗传差异性分析结果表明广宁红花油茶遗传变异主要来源于种群内，因此，在广宁红花油茶遗传改良的初级阶段，应该重点在种群内个体之间开展选择，对广宁、大南山和增城等遗传多样性指数较高的种群，可加大选择权重，但是对清远和云浮等遗传多样性指数较低的种群，也应予以重视。

遗传距离体现了不同地区种群的亲缘关系，由4个种群的遗传距离和遗传一致度可以看出，广宁红花油茶种群间的遗传差异较小，亲缘关系比较近，特别是广东增城与广东云浮，两者的遗传距离在4个种群间为最小，亲缘关系最近。虽然不少学者认为林木居群间遗传差异的大小跟地理因子密切相关，但也有学者却认为两者之间并非存在着必然的联系[22-23]。通过UPGMA结果显示，广宁红花油茶种群聚类与地理空间分布格局基本一致，如地理分布较近的广东增城与广东大南山最先聚在一起，但其他种源均未按照地理区域分布特征进行聚类，说明广宁红花油茶种群间的亲缘关系具有复杂性，其原因可能是：（1）样品选取的地理种群数量较少，不同种群的个体数量差异比较大，引物组合较少，不能很好的反映其遗传一致度，今后应加大种群、样品及引物组合数量；（2）选取样品的范围较小，种源地较近，环境差异较小，使其基因型差异较小；（3）遗传上的高度杂合也导致其具有较高的遗传多样性。

目前，针对广宁红花油茶研究较少，可应用于广宁红花油茶优良种质分子鉴别研究的SRAP引物较少，因而还需加大引物开发力度，其次，种源地理分布距离近，数量少，需进一步扩大种源及个体数量。虽然 SRAP 技术已被广泛，但同样的方法在不同植物中的应用会有差异[24]，同时，因为分子标记技术也存在扩增条带统计误差较大等缺点，不能完全真实地反映样本的遗传多态性，所以在今后的研究中，需继续开展不同的分子标记技术比较，再与其他研究方法相结合，才能更加全面、准确地反映广宁红花油茶种质资源的遗传多样性。

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Genetic diversity ofCamellia semiserrataChi germplasm based on SRAP markers

XIE Hui1, ZHU Wenjuan1, ZHANG Yingzhong2, JIANG Kaibin1, LIU Tianyi1, MO Qihui3, HUANG Shaowei1
(1. College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China; 2. Guangdong Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangdong, China; 3. Guangning Institute of Forestry, Guangning 526300, Guangdong, China)

In order to establish the evaluation system of genetic diversity of 153 individule tree from 4 populations inCamellia semiserrataChi of Guangdong Province, 13 pairs of SRAP primers were selected from 594 combinations and applied to analyze the genetic diversity. The results showed that a total of 206 fragments was ampli fied, and the average ampli fied fragments of each primer pair were 15.85. There were 206 polymorphic bands, and the percentage of polymorphic bands(PPB) was 90.78%. The Nei’s gene diversity(h), Shannon’s information index(I) and percentage of polymorphic loci (PPL) of different populations were 0.2179-0.3563,0.321 7-0.524 8 and 58.25 %-92.72 %, with the average 0.307 8, 0.456 3 and 83.62 %, respectively, showing rich genetic diversity at population ofC. Semiserrata. The dendrogram indicated that when the threshold was 0.93, 4 populations ofC. semiserratawas divided into two major categories that Qingyuan population was one group and the second group included populations of Guangning County,Zengcheng and Yunfu. Genetic distance of Yunfu and Zengcheng was minimum(0.0193) showing a closer relationship for these two populations. The analysis of molecular variance (AMOVA) showed the 95% of the genetic variation existed within populations and 5%among them.

Camellia semiserrata; germplasm resources; SRAP maker; genetic diversity

S792.33

A

1673-923X(2017)08-0093-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2017.08.016

2016-02-29

林业公益性行业科研专项（201204303）

谢 荟，硕士研究生

黄少伟，教授；E-mail： shwhuang@scau.edu.cn

谢 荟，祝文娟，张应中,等.基于SRAP分子标记的广宁红花油茶种质资源遗传多样性研究[J].中南林业科技大学学报，2017, 37(8): 93-97, 113.

[本文编校：文凤鸣]