microRNA调控自噬在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展

杨红星,李绍旦 综述 杨明会 审校

心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是指在原发或继发的缺血性心脏疾病中恢复心肌缺血部位的血液供应后却加剧了缺血心肌的应激反应和细胞死亡的病理生理过程。导致MIRI的具体机制是复杂的，包括营养缺乏、再灌注活性氧应激、线粒体通透性转换孔开放、再灌注导致的钙紊乱、心肌细胞内pH值的快速变化[1]等，MIRI往往是它们多方面作用的结果。

自噬是高度进化保守的细胞内降解长寿命蛋白和受损细胞器的生理反应。自噬是细胞内依赖溶酶体的“自我消化”行为，能够清除胞质内入侵病毒、大分子异常蛋白和衰老受损细胞器[2]，是细胞内固有的应激反应和防御机制。自噬与心血管或肌肉组织疾病、神经系统疾病、衰老和肿瘤等多种疾病有关。根据包裹物和运输方式不同，可将自噬分为巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)、分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)，以及新发现的DNA自噬[3]和RNA自噬[4]，通常所谓的自噬是指巨自噬。心肌细胞通过自噬途径降解受损的线粒体等细胞器，维持细胞内能量平衡与环境稳定，从而抑制细胞凋亡发生。不少研究均已确定，自噬参与了MIRI的病理过程，并发挥着有益或有害的不同效应[5]。综合性的研究[6]认为，再灌注期自噬的具体作用可能与缺血期缺血程度、缺血时间、自噬的激活程度、自噬与凋亡之间的交互作用、甚至所用模型和评价自噬的方法等有关。另外，自噬的具体作用还可能与诱发因素有关，营养缺乏、缺氧、感染、活性氧应激等不同的诱发因素，可导致自噬完全不同的作用。显然自噬能够相应地改变缺血再灌注损伤程度并对损伤心肌具有潜在的保护作用。因此深入研究自噬机制和调控通路十分重要。

1 MIRI中自噬的调控机制

1.1AMPK途径5′单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)即AMP依赖的蛋白激酶，是生物体能量代谢调节的关键分子。心肌缺血缺氧导致ATP水平下降，激活AMPK而诱导自噬。心肌缺血时以ATP为代表的能量水平下降， AMPK感知能量不足后被激活，诱发ULK1活化，启动自噬起始环节[7]。例如PL菌丝体预处理部分地通过增加AMPK磷酸化水平上调自噬减少大鼠MIRI[8]。

1.2mTOR途径雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是心肌缺血阶段调控自噬的核心蛋白，作为胞内能量感受体，它有两种复合物形式：mTORC1和mTORC2，诸多调控方式通过抑制mTOR上调自噬缓解MIRI。例如，升高miRNA-221表达量能够通过mTORC1/p-4EBP1途径抑制自噬从而缓解缺氧/复氧导致的H9c2心肌细胞和新生大鼠心肌细胞损伤[9]。黄连素降低mTORC2磷酸化水平后进而抑制自噬显著提高了H9c2心肌细胞存活率，减少了小鼠心肌梗死面积[10]。

1.3HIF-1参与的缺氧诱导自噬调控缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1，HIF-1)是一种核转录因子，能够调节氧稳态，使细胞适应缺氧环境。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β亚基组成，其中HIF-1α是缺氧期间的调节亚基。缺氧/复氧模型能显著提高HIF-1的转录水平和蛋白表达水平。例如HIF-1α过表达或敲低可分别促进或抑制缺氧引起的自噬诱导，从而证实HIF-1介导的自噬能够减轻缺氧诱导的H9c2细胞活力的降低[11]。

1.4活性氧和钙活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)广泛参与缺血再灌注后的损伤，是MIRI最重要的作用机制之一。再灌注期大量的ROS干扰线粒体膜极性与膜的完整性，增加线粒体通透性转换孔开放，或对DNA造成损伤，导致大鼠心肌细胞凋亡或自噬性死亡增加[12]。钙和钙调蛋白在MIRI中也是诱导自噬的因素，MIRI中抑制Na+/Ga2+离子转运蛋白就可以减少线粒体钙超载从而降低过高的自噬水平[13]。再灌注期细胞膜Na+/Ga2+交换通道开放增加，使细胞内Ca2+浓度升高，通过mTOR依赖途径进一步增强自噬。且肌浆网钙泵抑制剂能显著抑制细胞内Ca2+浓度从而抑制自噬，表明Ca2+浓度可影响再灌注期自噬水平[14]。

1.5NF-κB参与NF-κB是最初于B淋巴细胞中鉴定出的一种核转录因子，能够被感染、ROS等多种刺激因素诱导入核，上调相关基因表达，调控炎症反应、凋亡与自噬水平。在人脐静脉内皮细胞中发现缺血再灌注损伤能够促进依赖于p65-Beclin1的自噬水平升高，而抑制NF-κB可以降低 Beclin1参与的自噬流活化程度，增加细胞损伤[15]。

1.6内质网应激和未折叠蛋白反应MIRI过程中，ROS干扰胞内代谢平衡，扰乱了位于内质网内的蛋白折叠过程，激起内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)，未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)同样参与其中。ERS和UPR能够选择性地减少蛋白质翻译及合成、诱导自噬对已经错误折叠的蛋白质的清理，并能够通过UPR三个信号传感器IRE1、PERK和 ATF6将信号(例如通过真核启动因子eIF2α)传递到细胞核或细胞质引发自噬[16]。

MIRI中自噬的调控机制与作用是多方面的，因此在MIRI中通过调控自噬处于恰当的水平显示了对MIRI的良好治疗前景。在MIRI和自噬机制中，microRNA近年来越来越引起人们的关注。microRNA是高度保守的长度为18～24个核苷酸的内源性单链非编码RNA，被认为具有与靶mRNA的特异性结合位点结合后促进降解或抑制靶mRNA翻译来行使转录后调控的作用。microRNA在细胞生长、增殖、分化、凋亡等方面具有重要的调控作用，而且，microRNA在心血管系统疾病过程包括MIRI中扮演了重要角色。因此，深入探索microRNA在MIRI中的作用与详细机制具有十分重要的临床意义。目前已报道多种microRNA通过调控自噬相关基因(autophagy related gene,ATG)或自噬调节因子干预自噬水平，在MIRI中扮演了重要角色。因此本文着重综述microRNA通过调节自噬进而缓解MIRI的作用与机制。

2 microRNA调节自噬的不同环节

自噬的具体机制包括自噬的诱发、自噬泡开始形成、自噬泡延伸并识别包裹待降解的胞质成分、自噬泡与溶酶体融合、降解自噬泡内容物以供能量循环利用[17]。microRNA能够通过不同途径调控自噬的绝大部分过程。

2.1自噬的诱发阶段哺乳动物细胞自噬的发生常见于能量危机或激素、生长因子、钙离子、Bcl-2、ROS诱导时，始于mTOR或classIIIPI3K活化，导致ULK复合物(包括Atg1、Atg13、Atg17、Atg101)的激活。有研究[18]证实，miRNA-21在H9c2心肌细胞中激活Akt/mTOR通路,可能通过抑制ULK复合物下调缺氧/复氧模型的自噬流而减少细胞凋亡。miRNA-20a和miRNA-106b在C2C12成肌细胞中通过抑制ULK1的活化下调自噬[19]。另据报道miR-93能够靶向调控ULK1并在缺氧条件下降低其蛋白表达水平从而抑制自噬[20]。

2.2自噬泡的形成与延伸初始自噬膜的形成需要PtdIns3K复合物的活化，它由PtdIns3K、Vps34、Vps15、Atg14和Atg6/Vps30(哺乳动物中的同系物Beclin1)组成。自噬泡的成核涉及包含PIK3C3/VPS34-PIK3R4/VPS15(磷酸肌醇-3-激酶)-BECN1-ATG14的磷脂酰肌醇3-激酶(PtdIns3K)复合物[21]。PtdIns3K复合物产生PtdIns3P(3磷酸-磷脂酰肌醇)，并募集多个自噬蛋白如Atg18、Atg20、Atg21和Atg24 (100,105,141)而成核，进而募集两个泛素样蛋白酶体Atg12-Atg5-Atg16和Atg8(在哺乳动物中的同系物就是LC3蛋白，是自噬活化的标记蛋白)-PE，促进自噬小体的膜伸长和扩大[22]。其中值得重点关注的是Atg8也就是LC3蛋白的羧基末端被蛋白酶Atg4B切割后形成胞质蛋白形式LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ进一步被磷脂酰乙醇胺脂化成为LC3-Ⅱ形式，后者可被募集到自噬泡膜上。通常由LC3-Ⅱ与LC3-I的比值可以评价自噬的活化程度。miRNA-30a、miRNA-376b[23]和miRNA-519a[24]抑制Beclin1从而抑制自噬泡初期的成核作用。miRNA-93能够阻止LC3-I向LC3-Ⅱ的转化,阻止它们被募集到自噬泡膜上从而起到抑制自噬体膜延展的作用[20]。有研究[25]显示，一种被称为ARC的抗自噬蛋白的靶标是Beclin1，而miR-325能够通过抑制ARC进而抑制Beclin1下调自噬。Atg14是Ptdlns3(磷脂酰肌醇)激酶3复合物之一的特异性亚单位，能够将Ptdlns3复合物靶向对标自噬体形成的可能位点，因此对自噬初始阶段成核作用十分重要。有研究[26]认为抑制miRNA-130a能够上调Atg14水平，激活自噬而缓解新生SD大鼠心肌细胞的缺氧/复氧损伤。miRNA-181a和miRNA-374a[24]通过抑制Atg5下调自噬。miRNA-375[27]通过负性调控Atg7抑制两个泛素蛋白酶体系统介导的自噬泡的延伸。类似地，miRNA-630通过抑制Atg12，阻止泛素蛋白酶体系统形成Atg12-Atg5-Atg16复合物，抑制自噬膜的延展[24]。

2.3自噬体与溶酶体的融合自噬体成熟后，其双层膜的外膜和溶酶体膜融合为一，内膜以及自噬体内容物一起被溶酶体酶降解——所得的单层膜囊泡被称为自噬溶酶体。这种融合依赖于细胞内微管，由Rab7-SNARE、SKD1等蛋白以及溶酶体膜蛋白LAMP1/2参与。此外UVRAG可与PtdIns3K复合物结合,激活GTPaseRAB7后,促进自噬体与溶酶体的融合[22]。研究[28]显示成熟自噬体膜上存在一种被称为syntaxin 17的SNARE,通过与SNAP29和SNARE VAMP8相互作用促进了自噬溶酶体的形成。目前尽管没有发现直接作用于自噬体和溶酶体融合阶段的miRNA，但miRNA-98、miRNA-124、miRNA-130、miRNA-142、miRNA-204等可能通过抑制LAMP1/2和V-SNARE蛋白和囊泡相关膜蛋白7(VAMP7)，对自噬起负调控作用。例如，最新证实miRNA-33的直接靶标即包含溶酶体相关膜蛋白LAMP1并能降低其表达，从而显示出抑制自噬的作用[29]。此外，UVRAG作为一种促自噬蛋白，能够通过调控Vps复合体，使RAB7活性增强，促进自噬溶酶体的形成，miRNA-630和miRNA-374能够调控UVRAG，则可推测该2个miRNA在促进自噬体与溶酶体的融合过程中扮演了重要角色[30]。

3 结语

近年来自噬研究呈明显增加的趋势，从自噬的诱发到自噬体与溶酶体融合过程中不断有新的自噬基因被鉴别出来，自噬的调控因素也不断被深入研究。microRNA作为转录后调控的重要形式，在各类细胞自噬中举足轻重。虽然microRNA直接参与自噬体与溶酶体融合过程中的研究尚有不足，但是很多microRNA通过更广泛的间接调控干预自噬。随着人们对microRNA调控自噬机制研究的不断深入，通过microRNA与自噬机制作为直接或间接药物靶点或干预策略将越来越清晰地展现出其临床应用前景。