不同动物源生产用多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因序列分析

李伟杰，魏财文，岂晓鑫，田 野，蒋 颖，蒋桃珍

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

不同动物源生产用多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因序列分析

李伟杰，魏财文，岂晓鑫，田 野，蒋 颖，蒋桃珍*

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

为了解国内不同动物源生产用多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的变异情况，采用PCR方法对16株不同动物源生产用多杀性巴氏杆菌的ompH基因进行扩增测序和分析。结果显示：16株菌株的ompH基因开放阅读框在1002～1056 bp之间；信号肽为N端20个氨基酸残基，成熟蛋白氨基酸残基数量在313～331 aa之间，氨基酸同源性为82.1%～100%；基于OmpH氨基酸序列的系统发育树中鸡源菌株(荚膜A型)、猪源和牛源菌株(荚膜B型)分别在不同的分支。序列分析结果表明，ompH基因序列差异与荚膜型之间存在相关性，而与毒力大小无相关性。

多杀性巴氏杆菌；ompH基因；序列分析

多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)是引起畜禽巴氏杆菌病的病原体，主要使动物发生出血性败血病或传染性肺炎，如牛出血性败血症、猪肺疫、禽霍乱、兔巴氏杆菌病、猪萎缩性鼻炎等[1]。多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白在病原与宿主的互作以及宿主对感染的免疫应答中扮演着重要的角色[2]。其中OmpH是外膜蛋白的主要结构成分，同时也是主要的保护性抗原，属于跨膜非特异性孔蛋白，能诱导机体产生保护性免疫反应[3]。Lee将ompH基因在大肠杆菌BL21中进行表达，表达产物用BALB/c小鼠进行免疫保护试验，结果表明全长OmpH蛋白具有与全菌相当的保护率[4]。本试验选择我国不同动物源的16株生产用多杀性巴氏杆菌的ompH基因作为研究对象，以期了解其在遗传进化上的关系，为开展基于OmpH蛋白的检测与研究新型高效疫苗提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌株 多杀性巴氏杆菌CVCC 428、1765、44401(猪源，荚膜B型)，CVCC 44801、44802、44808、2082(鸡源，荚膜A型)，CVCC 44502(黄牛源，荚膜B型)，44701、44702、44703(牦牛源，荚膜B型)，CVCC 44601、44602、44603(水牛源，荚膜B型)，CVCC 44501、44507(牛源，荚膜B型)，以上16株生产用菌株均由中国兽医微生物菌种保藏管理中心提供。

1.2 细菌基因组DNA的提取 采用热裂解法[5]提取细菌基因组DNA，将冻干菌种用TSB肉汤溶解后，划线接种含5%马血清的TSA琼脂平皿，37 ℃培养24 h，挑取菌落加入100 μL无菌蒸馏水中，沸水浴10 min，立即冰浴5 min，12000 r/min离心1 min，取上清作为DNA扩增模板。

1.3 引物设计与合成 参照文献[6]的报道，由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成多杀性巴氏杆菌ompH基因扩增的引物，预期的PCR产物包含了ompH基因完整的开放阅读框，引物信息见表1。

表1 引物信息Tab 1 The information of primers

1.4 PCR反应体系及反应条件 PCR反应体系：10×Ex Buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，ompH-F(10 μmol/ L)1 μL，ompH-R(10 μmol/ L)1 μL，模板2 μL，Ex Taq 酶(5 U/μL)0.25 μL，加灭菌双蒸水至50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸7 min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物测序由中美泰和生物技术(北京)有限公司完成。

1.5 序列分析 应用Mega7软件和Lasergene 7软件中的MegAlign对菌株的ompH基因序列及其推导的氨基酸序列进行比对，分析各菌株之间的同源性及变异程度，并采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树。SignaIP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP/)分析信号肽。ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)预测氨基酸的相对分子质量、等电点、稳定性指数等理化性质。用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测蛋白潜在的跨膜域。

2 结果与分析

2.1 多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的扩增及序列分析 应用特异性引物扩增多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因，经电泳检测，16株菌株均在1.5 kb处有1条电泳条带，结果与预期相符(图1)。利用Contig CExpress软件进行序列拼接，然后提交到GenBank进行BLAST比对，结果发现16个菌株的ompH基因开放阅读框在1002 bp～1056 bp之间，其中CVCC 44801、44802、44808、2082为1056 bp，CVCC 428、1765、44401、CVCC 44601、44602、44603、44501、44507为1008 bp，CVCC 44701、44702、44703、CVCC 44502为1002 bp。16株菌株ompH基因核苷酸同源在83.0%～100%之间(图2)。

M:DL2000 DNA Maker；1-16：CVCC 428、1765、44401、44801、44802、44808、2082、44502、44701、44702、44703、44601、44602、44603、44501、44507；CK:阴性对照M:DL2000 DNA Maker；1-16：CVCC 428、1765、44401、44801、44802、44808、2082、44502、44701、44702、44703、44601、44602、44603、44501、44507；CK: Negative control图1 多杀性巴氏杆菌ompH基因PCR产物Fig 1 PCR products of ompH gene of P.multocida

图2 多杀性巴氏杆菌ompH基因同源性Fig 2 Percent identity based on ompH gene of P.multocida

2.2 多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H氨基酸的序列分析 16株菌株根据ompH基因推导的氨基酸同源性在82.1%～100%之间(图3)，比对结果发现CVCC 44801、44802、44808、2082(鸡源，荚膜A型)氨基酸序列完全相同，CVCC 428、1765、44401(猪源，荚膜B型)氨基酸序列完全相同，CVCC 44601、44602、44603(水牛源，荚膜B型)和CVCC 44501、44507(牛源，荚膜B型)氨基酸序列完全相同，CVCC 44701、44702、44703(牦牛源，荚膜B型)和CVCC 44502(黄牛源，荚膜B型)的氨基酸序列完全相同；鸡源菌株的氨基酸序列与猪源、牛源菌株的氨基酸序列同源性相对较低，在82.1%～83.2%之间，在系统发育树上形成一个单独的分支(图4)；猪源菌株间、牛源菌株间以及二者之间的氨基酸序列同源性较高，均在98%以上，在系统发育树上在同一分支(图4)。

图3 多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白同源性Fig 3 Percent identity based on OmpH protein of P.multocida

图4 多杀性巴氏杆菌OmpH蛋白系统发育树Fig 4 Phylogenetic tree based on amino acid of the OmpH protein of P.multocida

SignaIP 4.1预测结果发现，16株菌株的信号肽均为N端20个氨基酸残基，且序列完全相同，因此推断菌株的成熟蛋白氨基酸残基数量分别为313、315和331。利用ProtParam软件对OmpH蛋白进行分析，结果显示成熟蛋白理论分子质量在33.79～36.46 ku之间，且鸡源(荚膜A型)菌株蛋白的分子质量较大；等电点为6.55～9.12，不稳定系数为12.94～14.94，说明蛋白较稳定。TMHMM Server v. 2.0没有发现潜在的跨膜区域。对鸡源(荚膜A型)、猪源(荚膜B型)和牛源(荚膜B型)菌株的OmpH成熟蛋白的氨基酸进行比对分析发现存在缺失和变异，蛋白长度有所差异，在70～80和200～210处氨基酸属于高变区(图5)。

图5 多杀性巴氏杆菌OmpH成熟蛋白氨基酸序列Fig 5 Sequence alignment of OmpH mature protein of P.multocida

3 讨 论

已有的研究表明，OmpH蛋白是致病因子，在对宿主的感染与致病过程中发挥重要的作用[7-8]。同时OmpH蛋白研究表明也是一种主要的保护性抗原，Tan在大肠杆菌M15中对多杀性巴氏杆菌1710的ompH基因进行克隆和表达，BALB/c小鼠保护试验表明腹腔免疫、攻毒，保护率为100%，皮下免疫、腹腔攻毒，保护率为80%[9]；恩特马克·布拉提白对CVCC458的ompH基因进行克隆和表达，结果显示免疫组小鼠对同源菌株和异源菌株的保护率分别为100%和80%[10]。基于ompH基因非常稳定地存在于不同荚膜型的多杀性巴氏杆菌的基因组中，因此有望成为一种对所有荚膜型产生保护的候选抗原。

本试验对16株生产用多杀性巴氏杆菌的ompH基因进行扩增和序列分析发现，不同动物源、不同荚膜型的多杀性巴氏杆菌的ompH基因大小存在差异，鸡源菌株(荚膜A型)较猪源、牛源菌株(荚膜B型)的ompH基因多48～54个碱基；但不同动物源、不同荚膜型的多杀性巴氏杆菌ompH基因推导的氨基酸同源性较高，在82.1%～100%之间。以上结果提示OmpH作为亚单位疫苗使用可能提供同源和异源保护，但还有待于进一步研究。试验中还发现荚膜A型与荚膜B型菌株在基于OmpH蛋白氨基酸序列构建的系统发育树中位于不同的分支，说明两者之间存在相关性；分离自猪源的3株不同毒力的多杀性巴氏杆菌中，弱毒株CVCC 1765、CVCC 428和强毒株CVCC 44401，尽管毒力相差很大，但它们之间ompH基因同源性为100%，说明ompH基因与毒力大小无相关性。

[1] 陆承平. 兽医微生物学[M]. 第5版. 北京：中国农业出版社，2012.

Lu C P. Veterinary microbiology[J]. The fifth edition. Beijing: China Agriculture Press, 2012.

[2] Hatfaludi T, Al-Hasani K, Boyce J D，etal. Outer membrane proteins ofPasteurellamultocida[J]. Veterinary Microbiology, 2010, 144(1/2)：1-17.

[3] Luo Y, Glisson J R, Jackwood M W,etal. Cloning and characterization of the major outer membrane protein gene (ompH) ofPasteurellamultocidaX-73[J]. Journal of Bacteriology, 1997, 179(24): 7856-7864.

[4] Lee J, Kim Y B, Kwon M. Outer membrane protein H for protective immunity againstPasteurellamultocida[J]. Journal of Microbiology, 2007, 45(2): 179-184.

[5] 李伟杰，田 野，岂晓鑫，等. 禽源多杀性巴氏杆菌多位点序列分型研究[J]. 中国兽药杂志，2017，51(2)：1-6.

Li W J, Tian Y, Qi X X,etal. Multi-locus sequence typing ofPasteurellamultocidaisolated from avian[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2017, 51(2):1-6.

[6] 李伟杰，魏财文，田 野，等. 猪源多杀性巴氏杆菌荚膜分型及外膜蛋白H基因序列分析[J]. 中国畜牧兽医，2015，42(1)：0032-0037.

Li W J, Wei C W, Tian Y,etal. Capsular typing and sequencs analysis of theompHgene ofPasteurellamultocidafrom swine[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2015, 42(1): 0032-0037.

[7] Khamesipour F, Momtaz H, Azhdary Mamoreh M. Occurrence of virulence factors and antimicrobial resistance inPasteurellamultocidastrains isolated from slaughter cattle in Iran[J]. Front Microbio, 2014, 5:536.

[8] 韦 东，吾鲁木汗·那孜尔别克，段世雄，等.禽多杀性巴氏杆菌C48-3株外膜蛋白H的致病作用[J]. 中国生物工程杂志，2014，34(6)：31-39.

Wei D, Wulumuhan N, Duan S X,etal. Role of outer membrane protein in the pathogenesis of avianPasteurellamulticidastrain C48-3[J]. China Biotechnology, 2014, 34(6):31-39.

[9] Tan H Y, Nagoor N H, Sekaran S D. Cloning, expression and protective capacity of 37 kDa outer membrane protein gene (ompH) ofPasteurellamultocidaserotype B∶2[J]. Tropical Biomedicine, 2010, 27(3): 430-441.

[10] 恩特马克·布拉提白，彭清忠，严 芳，等.禽多杀性巴氏杆菌粘附蛋白Cp39的交叉免疫保护作用[J]. 微生物学报，2010，50(3)：360-366.

Entomack B, Peng Q Z, Yan F,etal. Cross-protective effect of the Cp39 adhesive proteins against avianPasteurellamulticidain mice[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2010, 50(3):360-366.

SequencesAnalysisonompHGeneofPasteurellamultocidaIsoltatedfromDifferentAnimalsforProducingVaccine

LI Wei-jie, WEI Cai-wen, QI Xiao-xin, TIAN Ye, JIANG Ying, JIANG Tao-zhen*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

JIANGTao-zhen，E-mail:jiangtaozhen@ivdc.org.cn

In order to understand the variation of outer membrane protein H gene，theompHgene of 16P.multocidastrains were examined and analysed by PCR method. The results showed that the open reading frames of ompH gene were from 1002 to 1056 bp. The predicted mature proteins were composed of 313 to 331 amino acids except the signal peptide including 20 amino acid residues in N terminal. The alignment data indicated that the homology of amino acid were from 82.1% to 100%. The phylogenetic tree constructed by the OmpH protein showed that the strains isolated from avian (capsular type A), swine and cattle (capsular type B) were in different branches. The relationship were found between the sequence divergence ofompHgene and the capsular type, but not with the virulence.

Pasteurellamultocida;ompHgene; sequence analysis

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.12.02

2017-03-29

A

1002-1280 (2017) 12-0007-06

S852.61

国家微生物资源平台(NIMR-5)

李伟杰，副研究员，从事兽医微生物与兽用生物制品研究。

蒋桃珍。E-mail：jiangtaozhen@ivdc.org.cn

(编辑：李文平)