随机扩增多态性DNA技术对绿色气球菌的相关性分析

王 羽，董文龙，张喜庆，马红霞，高云航

(吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118)

随机扩增多态性DNA技术对绿色气球菌的相关性分析

王 羽，董文龙，张喜庆，马红霞，高云航*

(吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118)

随着分子生物学的发展，16S、23S rRNA以及16S～23S rRNA已应用于菌种鉴定。16S～23S rRNA的基因间隔区相对于前两者有较高的变异性，弥补了16S和23S rRNA保守性强，分化程度不够的缺点。本研究对7株绿色气球菌和两株屎肠球菌扩增16S～23S rRNA基因间隔序列。通过随机扩增多态性DNA技术分析绿色气球菌DNA，评价不同菌株间的克隆相关性及耐药性。

绿色气球菌；16S～23S rRNA；随机扩增多态性DNA技术

绿色气球菌属于条件致病菌，广泛分布于自然界。该菌可以在免疫力低下，开放性外伤，静脉置留管及烧伤患者的血液、尿液、脑脊液、伤口组织液等标本中分离出，是重要的机会致病菌[1]。在细菌进化过程中，rRNA基因的进化相对保守，被认为是衡量生命进化史最理想的标尺[2]。由于16S和23S基因在同一属内的不同菌株间的同源性太高，无法区分某些种系非常接近的种和型，因此必须找到其他种特异性序列[3]。国外研究已经证实16S～23S rRNA ISR序列的进化率要强于16S rRNA基因的10倍[4]。因此，16S～23S rRNA ISR更适合区分不同细菌的特点。1990年，由Williams等基于PCR技术之上首次推出了一种简单、灵敏可行的遗传标记技术--随机扩增多态性DNA[5]。在随机扩增多态DNA中，用任意选择的核苷酸序列的引物扩增基因组DNA，不同菌株的RAPD指纹可以根据PCR产物的数量和大小进行比较[6]。这些扩增的DNA片段多态性反映出基因组DNA相应区域的多态性。本研究对7株绿色气球菌及2株屎肠球菌PCR扩增16S～23S rRNA ISR全序列，并通过随机扩增多态性DNA技术分析绿色气球菌DNA，为评价不同菌株间的克隆相关性及耐药性提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌种 7株绿色气球菌及2株屎肠球菌由吉林农业大学动物科学技术学院预防兽医学研究室分离保存。

1.2 主要试剂 胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)，购自青岛高科园海博生物技术有限公司。胎牛血清购自于北京元亨圣马生物技术研究所。ExTaq酶、dNTP、DNA Marker 2000、6×ExBuffer购自Takara公司。胶回收试剂盒购自康宁生命科学(吴江)有限公司，细菌基因组提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列及PCR条件Tab 1 Primer sequences and PCR condition

a-1=35x(93oC 60s, 52oC 60s, 72oC 120s); 2=35x(94oC 30s, 40oC 45s, 72oC 45s).

以提取的DNA为模板，对基因间隔区和多态性进行扩增。将基因间隔区PCR产物进行胶回收纯化，将纯化的PCR产物和pMD-18T连接过夜，将连接产物转化到E.coli.DH5α感受态细胞，按照试剂盒提取质粒进行验证，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.4 微量稀释法药敏试验 用TSB液体培养基溶解11种抗菌药物，并将药物稀释至2048 μg/mL。应用微量稀释在无菌96孔培养板对抗菌药物进行二倍梯度稀释，使药液的终浓度由512 μg/mL至0.03 μg/mL，共15个浓度梯度。将终浓度为106CFU/mL菌液 加入含有抗菌药物的96孔板内，并设置对照，于37 ℃恒温培养24 h，进行3次重复性试验。试验结果参考CLSI动物源细菌药敏试验标准。

2 结果与分析

2.1 16S-23S rRNA IGS序列扩增 以DNA为模板，扩增绿色气球菌与屎肠球菌ISR引物，7株绿色气球菌均在约500、600、750 bp处扩增出3条带，两株屎肠球菌均在约600 bp处扩增一条带，结果如图1。

将主条带进行切胶、连接、转化并送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序，7株绿色球菌菌株扩增序列与GenBank上已公布的绿色气球菌16S～23S rRNA基因间隔序列(登录号JN977134.1)同源性达到99%，并建立进化树如图2。

M:DL2 000 DNA Marker;Ae-1-- Ae-7:绿色气球菌;Ef-1--Ef-2:屎肠球菌M:DL2 000 DNA Marker;Ae-1-- Ae-7:Aerococcus viridians;Ef-1--Ef-2:Enterococcus faecium图1 16S～23S rRNA ISR基因序列PCR电泳图Fig 1 PCR electrophoresis of 16S～23S rRNA ISR gene sequence

Ae-1--Ae-7:绿色气球菌；Ef-1, Ef-2:屎肠球菌图2 绿色气球菌与屎肠球菌16S～23S rRNA ISR系统进化树Fig 2 Phylogenetic tree of 16S～23S rRNA ISR of Aerococcus viridians and Enterococcus faecium

2.2 绿色气球菌多态性序列扩增 绿色气球菌RAPD 产物经1%琼脂糖凝胶电泳EB染色结果如图3。应用引物ERIC 1R在7株绿色气球菌扩增出5个分子量明显不同的特异性片段，不同菌株扩增出3类RAPD指纹。Ae-1与Ae-6有相似的指纹图谱，Ae-2与Ae-3有相似的指纹图谱，Ae-4、Ae-5与Ae-7有相似的指纹图谱，证明所有分离菌株有限的变异性。

M：DL2 000 DNA Marker; Ae-1--Ae-7:绿色气球菌M：DL2 000 DNA Marker; Ae-1-- Ae-7: Aerococus viridians图3 绿色气球菌RAPDA PCR电泳图Fig 3 PCR electrophoresis of 16S～23S rRNA ISR gene sequence

2.3 绿色气球菌药物敏感性分析结果 7株绿色气球菌对11种药物的敏感性分析如表2。Ae-1与Ae-6相同耐药谱。Ae-1与Ae-2有相似的耐药谱。Ae-3与Ae-4有相同的耐药谱。Ae-4、Ae-5与Ae-7相似的耐药谱。

表2 绿色气球菌药物敏感性分析结果Tab 2 The drugs resistance of Aerococcus viridians

3 讨论与小结

Matsuda等利用16S～23S rRNA基因的种属特异性引物建立了大肠埃希杆菌，粪肠球菌，金黄色葡萄球菌，产气荚膜梭菌和绿脓假单胞菌的分析曲线，通过检测肠道中的优势菌群，为肠道中共生细菌的检测和定量提供了敏感快速的方法[8]。近年来，国外已利用16S～23S rRNA基因区间用于菌种的鉴定及种系发育研究，如本实验根据参考文献合成16S 3'末端保守序列同23S 5'端保守序列通用引物，PCR扩增16S～23S rRNA ISR全序列。16S～23S rRNA ISR序列比较结果表明7株绿色气球菌有较高的同源性，两株屎肠球菌有较高的同源性且单独在一个分支上，表明16S～23S rRNA ISR序列在种间及属间具有较高的变异性，可以明显区分绿色气球菌同其他菌株。

1990年Williams等建立随机扩增多态性DNA方法[9]，RAPD分型是一种快速，可重复，高分辨率和经济的方法[10]。在本研究中，Ae-1与Ae-6有相似指纹又有相同耐药谱，提示它们可能来自同一克隆菌株，但可能发生了变异。Ae-2与Ae-3有相似指纹却表现出不同的耐药谱，说明它们可能来自同一克隆株，但发生了明显的耐药变异。Ae-4、Ae-5与Ae-7有相似的指纹亦有相似的耐药谱，提示它们可能来自同一克隆菌株，但可能发生了耐药变异。Ae-3与Ae-4有相同耐药谱却表现出不同RAPD指纹，它们不太可能来自同一克隆株且发生了耐药传播。因此，对菌株耐药谱的RAPD分析，可推断其克隆相关性于耐药谱的关系。

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DrugResistanceAnalysisofAerococcusviridiansbyRandomAmplifiedPolymorphicDNA

WANG Yu, DONG Wen-long，ZHANG Xi-qing, MA Hong-xia,GAO Yun-hang*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

GAOYun-hang,E-mail:gaoyunhang@163.com

With the development of molecular biology, the genes of 16S,23S and 16S～23S rRNA have been used in strain identification.The gene intergenic spacer(ISR) of16S～23S rRNA has a higher variability than the former two,which remedies the defects of the strong conservative and the lack of differentiations of 16S and 23S rRNA. In this study,we amplified the ISR of 7Aerococusviridianstrains and 2Enterococcusfaeciumstrains. We analysed the DNA ofAerococusviridianstrains and evaluated the clone correlations and resistances of different strains by randomly amplified polymorphic DNA(RAPD).

Aerococcusviridians; 16S～23S rRNA; RAPD

10.11751/ISSN.1002-1280.2017.12.04

2017-03-30

A

1002-1280 (2017) 12-0019-05

S855.1+1

王 羽，硕士生，从事动物疫病防治研究。

高云航。E-mail：gaoyunhang@163.com

(编辑：侯向辉)